更新的微型转座子载体用于细菌诱变或基因靶向
维克多·德·洛伦佐的实验室已经设计了一个模块化的mini-Tn5载体，可用于产生随机突变文库或将异源基因、报告基因或其他标记插入目标基因组。他们从现有的转座子和向量系统中选择重要的元素，并创建一个只包含功能所需元素的全合成向量。
实验室验证了这个载体，叫做pBAM1他们在土壤细菌恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)中进行随机诱变，并证明他们可以成功地在整个基因组中创建带有多种基因的绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白。虽然这个工具在2011年发布，它是最近才通过Addgene提供的，我们想强调它在您的研究中使用。
Martinez-Garcia et al .,BMC微生物学2011年2月22日; 11：38。
用于敲除筛选的慢病毒CRISPR文库
新的系统已经开发出来并与Addgene一起存放，这使得科学家可以使用CRISPR-Cas技术进行全基因组敲除筛选。这些vectors和sgrna文库扩大了克里斯特的质粒家族通过提供以慢病毒为基础的sgRNA传递机制，并为大规模功能筛选提供了一种手段。
有关这些新的CRISPR筛选工具的更多信息，请参阅我们的CRISPR/Cas质粒:Pooled Libraries网页或者阅读我们的博客文章，慢病毒克里普尔特图书馆启用基因组规模，淘汰筛选．
此外，请查看我们更新的CRISPR-Cas资源www.addgene.org/crispr/浏览CRISPR质粒，观看信息视频，下载协议等！寻找CRISPR技术的背景信息？看我们改进CRISPR-CAS指南．
王等。科学．2014.343年1月3;(6166):80 - 4。
Shalem等人。，科学2014.343年1月3;(6166):84 - 7。
Koike-yusa等人。，Nat生物技术．2013.12月23日。
高亮度和极暗的gfp
GFP的三维结构、其更明亮的突变体S65T-GFP以及随后的生化表征使得科学家能够设计出各种荧光亮度、强度、激发和发射光谱多样性的GFP。的Dimitri deheyn实验室最近在头索动物鳞口鳃科中发现了一个GFP蛋白家族，命名为bflogfp蛋白。他们继续描述了家族成员中的两个成员的结构和光谱特性——一个具有前所未有的高亮度，bfloGFPa1，另一个具有极微弱的亮度，bfloGFPc1。用于确定结构的质粒现在可以从Addgene -中获得bfloGFPa1和bfloGFPc1．
- Bomati et al .,Sci代表2014年6月27日,4:5469。
MitoTimer质粒报告线粒体周转
线粒体健康、转运和周转是研究线粒体功能障碍需要监测的重要特征。易于使用的工具来监控这些特性直到罗伯塔戈特利布和甄妍Labs开发了Mitotimer质粒。
Mitotimer蛋白质源自定时器蛋白 - 荧光蛋白的突变体DSRED，当它被氧化时，荧光蛋白DS的突变体可不可避免地变为红色。定时器工具已经被几个组用于监测蛋白质和细胞老化，因为由于氧化形式（脱氢），在定时器蛋白质寿命期间发生光谱移位。腐蚀剂由与细胞色素C氧化酶亚基VIII的线粒体靶向序列融合的定时器蛋白质组成，使得它们可以进口到线粒体基质。Gottlieb的实验室使用了一个使用TET-ON系统的诱导MitoTimer记者（pTRE-Tight-MitoTimer)，以显示其在细胞培养中用于报告线粒体周转和运输的变化。Pmitotimer.来自Yan的实验室，这是构成性表达，报告了生物发生和线粒体降解的平衡体外和在活的有机体内．
合并稳定地表达Ptre-ind-Mitotimer和RTTA的C2C12细胞的绿色和红色通道荧光图像。将细胞用2μg/ ml毒素脉冲2小时，并在脉冲后8小时内成像。网络中单个线粒体中红细胞荧光的明显差异标志着新合成（绿色）蛋白和具有较旧（黄色至橙色）蛋白的细胞器的进口的差异。图像由罗伯塔·戈特利布提供。
Laker等，J Biol Chem.2014年4月25日; 289（17）：12005-15。
Hernandez等。，自噬2013年11月1日; 9（11）：1852-61。
一种更快的蛋白质灭活方法
你感兴趣的蛋白质会参与x，但它也会参与y。蛋白质的消耗可能会上调另一种途径或诱导其他代偿机制。如何在最大限度减少混淆的次要影响的同时解剖蛋白质功能?
这种方法被描述为“翻倒”(英国俗语，意为“出其不意”)玛格丽特罗宾逊的实验室，最近被用于Stephen Royle的实验室，通过螯合的作用隔室急性耗尽的蛋白质。
该策略依赖于几种观察结果：雷帕霉素是一种膜渗透性药物，可以迅速诱导含有雷帕霉素结合结构域的蛋白质的异二聚化，例如FKBP和FRB。该细胞似乎介入外来蛋白质与其外部线粒体膜结合。
隔离是通过敲除你感兴趣的内源蛋白，并用一个FKBP结构域和一个带有FRB结构域的线粒体外膜蛋白(MitoTRAP)共同表达其替代重组蛋白来完成的。雷帕霉素结合你的重组蛋白(通过FKBP)，然后隔离蛋白质在线粒体(结合FRB)，允许快速和诱导失活。找到罗宾逊质粒或者是罗伊尔质粒并开始工作！
通过Golden Gateway Cloning组装来自构建块的多组分质粒
通过组装重组构建体的复杂性感到沮丧？一种新的克隆系统，结合了金门和多功能网关克隆方法的优势Joachim Wittbrodt实验室可能只是您需要的一组工具。
的金门克隆试剂盒简化了复杂DNA构建体的克隆方法，特别是对于涉及诸如FRT或LOX位点的重组元素的那些，并提供模块化系统，以便更容易地交换和重复使用现有元素。所需组分的DNA序列通过传统的限制酶克隆，Ta克隆或寡核苷酸的退火克隆到金栅进入载体中。这些条目向量用于金门克隆步骤中以预定义的顺序将各个组件组装到目的地向量中。最后，目的地向量与多路网关克隆一起使用以产生最终构造。
最多八个进入向量可用于每个多路网关兼容目标向量，最多24个元素组装成最终的转基因构建体。使用金色网关克隆构建的质粒已经利用来产生重组模板载体，进行多个位点诱变并产生复杂的融合或重组载体。高效且灵活的克隆过程提供了对经典克隆方法的改进，特别是对于复杂的转基因构建体。
Kirchmaier等。，普罗斯一体2013年10月7,8 (10):e76117。
使用SpyLigase进行不可逆肽-肽连接
建立了他们SpyTag / SpyCatcher系统对于蛋白质肽锁定，Mark Howarth的实验室开发了一种用于肽肽锁定的新工具。新技术被称为SpyLigase是一个蛋白质结构域，促进形成一个异肽键之间的2肽标签，SpyTag和KTag．本集团证明使用Spyligase肽 - 肽相互作用，以将辅助或抗体与常见的肿瘤标志物联系起来，以增强癌细胞捕获。
关于SpyLigase技术的进一步阅读，看看Addgene对Mark Howarth的采访．
照亮了通道视紫红蛋白-克罗诺斯和克里姆森
这篇论文描述了来自不同物种的五种以前未知的通道视紫红质:Stigleoclonium helveticum（shchr），衣藻noctigama(CnChR1),Chloromonas subdivisa（CSCHR），HalloMonas oogama.（Cochr），和Scherffelia dubia(SdChR)。ShChR，昵称为Chronos，是一种蓝色和绿色的光兴奋性物质，比其他通道视紫红素具有更快的动力学。CnChR1，又名Chrimson，是第一个报道的590 nm光谱峰的黄峰通道视紫红质，与其他变体相比，红移多了45 nm。组进一步通过诱变优化Chrimson (K176R)，改善动力学迟缓(从21.4±1.1 ms提高到15.8±0.4ms);这种新变种被命名为ChrimsonR。质粒含有Chronos，Chrimson，Chrimsonr，CSCHR和Cochr已存入Addgene，包括慢病毒和特定变异的AAV表达载体。
Klapoetke et al .,NAT方法2014年3月11日;(3):338 - 46所示。
想了解更多关于光遗传学质粒工具的信息和描述，访问Addgene光遗传学指南．
更多的光遗传学工具-光激活受体酪氨酸激酶
受体酪氨酸激酶（RTKS）是一类大类细胞表面受体，其在发育中发挥着关键作用，并且通常涉及疾病进展。信号调查中的主要挑战之一是无法复制的时空精度，其中信号传导事件发生在生理环境中。遗传技术通常依赖于过表达或崩落，其中信号动态受到蛋白质的相对较长的寿命的影响，从表达到降解。化学方法可能需要昂贵的肽或小分子，并在强度和/或持续时间内超过生理相关的暴露。这两项策略都带有偏离目标效应的风险。
Harald Janovjak和他的团队在奥地利科学技术研究所，决定采取一种对这些效果进行控制的新方法，在快速生长的视野上绘制。使用Rational蛋白质工程方法，它们设计了光环 - RTKS，其在暴露于低强度蓝光上激活信号级联。这种方法依赖于将来自藻类的光 - 电压（LOV）感测结构掺入到嵌合光学 - RTK中。LOV结构域将Flavin辅助因子结合并在暴露于光线上，使细胞内激酶结构域带入接触和启动信号传导。Grusch等人。证明Opto-RTK具有类似的背景活动水平和激活作为其野生型对应物。
Janovjak Lab已存入3个Opto-RTK构建体 -Opto-mFGFR1，Opto-hEGFR,光学速度-以及各种LOV-domain-mVenus构造在研究中用于那些希望将这项工作扩展到兴趣的RTK的人。
格鲁施等人，Embo J.2014年8月1;33(15):1713 - 26所示。
RNAi转基因小鼠中匆匆和粉碎 - 快速与条件基因沉默
布朗et al .,创世纪2014年1月,(1):52 39-48。
APEX2用于蛋白质组学制图和电子显微镜
对复杂生物系统的全面了解需要分子参与者的目录和环境知识，他们在细胞内的作用。最初的APEX(增强抗坏血酸过氧化物酶)报告从爱丽丝Ting的实验室与传统荧光显微镜相比，基因电子显微镜(EM)标记提供了更优越的亚细胞定位标记蛋白，并作为活细胞空间蛋白质组学定位的靶向工具。尽管有这些进展，Ting实验室的第一代APEX在严格的低表达条件下，活性水平不一致，敏感性有限，以避免各种环境中的生物扰动。为了克服这些限制，它们进化出了一种改进过氧化物酶报告，Apex2，通过酵母显示。在EM成像和邻近依赖蛋白质组学定位方面，APEX2均表现出优于APEX的表现，在低表达水平上，APEX2的敏感性要高得多。APEX2是一个单体的，27kd的基因标记，可以融合到感兴趣的蛋白质上进行EM成像，或者靶向到亚细胞区域或蛋白质复合物上进行活细胞的蛋白质组学定位。
CRISPR gRNA验证的新工具
选择一个有效靶向你感兴趣的基因/区域的gRNA序列是CRISPR/Cas9基因编辑的关键步骤。博士Masahito Ikawa为科学家创造了GFP报告体质粒，以验证他们的GRNA的疗效。
第一步是将目标序列克隆在EGFP的两个片段之间PCAG-EGXXFP.．EGFP片段含有482bp的重叠序列，其在DNA断裂发生时直接同源重组（HR）或单链退火（SSA）。接下来，测试的GRNA与CAS9一起表达。如果GRNA有效地切割靶序列，则质粒经历HR或SSA以重建功能性GFP，细胞将变绿。
Mashiko et al .,Sci代表2013年11月27日;3：3355。
RINEHART实验室试剂改善了重组磷蛋白的表达
蛋白质磷酸化是细胞中最丰富的翻译后修饰形式最丰富的形式之一，并且研究其在蛋白质功能和信号网络中的许多角色继续扩大。实验室Jesse Rinehart.和DieterSöll.通过将这种磷酸化氨基酸添加到大肠杆菌的遗传密码中，改变了研究人员探索围绕丝氨酸磷酸化的重要问题的方式(Park et al.， Science, 2011)。
莱因哈特实验室现在已经对该系统进行了改进，通过工程细胞缺乏释放因子1 (RF-1;细菌菌株Ecar7.)，并尽量减少制造单个或大量磷酸化蛋白质所需的质粒(B40 OTS.和pCRT7-GFP）.为了证明该系统的改进，Rinehart实验室合成了人丝裂原激活的ERK激活激酶1 (MEK1)的活化形式，其中一个或两个磷酸化丝氨酸残基以翻译方式插入它们的典型位置(SP218, SP222)，使用原始或改进的磷酸化蛋白合成试剂。一个磷酸化丝氨酸(SP218)插入适度增强，而两个磷酸化丝氨酸插入(SP218/SP222)显著增强。这MEK向量也可以在Addgene上找到，可以作为你实验的对照。更多信息，请参见Addgene的信息页Rinehart磷蛋白系统，其中包括莱因哈特实验室提供的详细协议。斯坦因费尔德et al .,ACS Chem Biol.2014年5月16日; 9（5）：1104-12。
Heinemann等，Febs Lett.2012年10月19日; 586（20）：3716-22。
Park等人。，科学2011年8月26日,333(6046):1151 - 4。
pOSIP和克隆集成
传统的基因工程方法使染色体整合细菌的序列是费时的和涉及许多步骤。的了恩迪和基斯Shearwin实验室开发了一种新的、流线型的基因工程方法，大大减少了将新基因插入细菌所需的时间和精力。他们设计了pOSIP(一步整合质粒)系列质粒，载体既传送要整合的序列，又传送可拆卸整合酶盒。他们在两种不同类型的细菌(大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌)中验证了这一方法，方法是依次或同时整合DNA序列。
这种方法由作者称为“clonegration”，很快且易于做到。随着它们的预测，克隆可能成为一种“有价值的技术促进了难以克隆序列的基因工程和迅速建设”。的posip质粒套件可以在Addgene找到，那么你还在等什么?开始培养你自己的设计细菌。
st-pierre等，ACS Synth杂志2013年9月20日;2(9):537 - 41。
基于Dreadd的化学技术
经过几年的分配他的设计受体专门激活的设计药物(DREADD)质粒自己，北卡大学教堂山的布莱恩罗斯现在有存放了许多这些结构Addgene。这些g蛋白偶联受体由Roth实验室设计，可以被药物惰性小分子激活，使实验室能够精确和非侵入性地控制神经元信号。
有关dreadd的更多信息，请参阅Roth Lab的Dreadd用户博客．
新的CRISPR质粒可用!
有兴趣净化Cas9吗？查看pET-28b-Cas9-His从亚历克斯Schier的实验室，用于在Rosetta E. coli中表达和纯化Cas9蛋白。新的慢病毒Crispr激活剂和阻遏质粒苏格兰沃尔夫的实验室．这些包括tet可诱导的CRISPR激活物和阻遏质粒．（kearns等人，发展．2014年..）
CRISPRs非洲爪蟾蜍!来自于实验室永隆陈，pCS2-3xFLAG-NLS-SpCas9-NLS是Cas9表达质粒，被陈和同事用于Genome编辑inxenopustropicalis。（Guo等，发展．2014年..）一种新的，更高的更高特异性基因组编辑系统，结合了Talens和Crisprs。开发的大卫刘和他的同事们,Foki-DCAS9.在哺乳动物细胞中表达与催化活性Cas9 dna结合域融合的Fok1核酸酶结构域。(桂林et al。生物科技Nat》．2014年..）
我们的CRISPR-CAS的质粒收集经常更新，所以访问我们的CRISPR页面通常用来查找最近存放的工具、资源、协议等。
MoClo模块化克隆系统
合成生物学家开发了一种模块化克隆策略，MoClo它使用IIS型限制性内切酶BsaI和BpiI/BbsI一次有效地组装多达6个DNA片段。这种方法(基于金门技术)利用IIS酶在其识别位点外剪切的能力，并允许具有兼容的外挂的DNA片段有效地组装。科学家可以设计独特的酶识别位点，以反向的方向夹带DNA模块，这样多个DNA组件可以在一个单一反应中定向组装，而只保留一个确定的4bp的融合位点。
的MOCLO系统由三组克隆载体（级别0,1或2）组成，其可以在三个连续的装配步骤中使用。在开始之前，科学家可以将含有碱性份数（启动子，UTRS，编码序列，终止剂等）的DNA的片段插入单个0级质粒，或者从含有预构造的标准化模块的较长数量的文库中选择。在第一组装步骤中，兼容的电平0载体定向地组装成1级载体，形成单个转录单元（例如：启动子，5'UTR，编码区域和终止子）。接下来，最多可以组装到六个级别的模块，从而形成级别2向量，从而形成功能遗传循环。在2级向量中建立了灵活性，以便在必要时允许额外的1级装配迭代。在最终组装步骤中结合多级2载体允许创建更复杂的构建体仅受到大肠杆菌在转化后维持最终质粒的能力的影响。
加入储层器叶Marillonnet和尼古拉赞助人已经组装了两组与MoClo系统兼容的标准化基因模块。Marillonnet实验室提供的MoClo工具包可用于组装一般的真核多基因构建物，而Patron实验室的MoClo植物部件工具包包含用于植物转化的特定模块。
Weber等。，普罗斯一体．2011年2月18日; 6（2）：E16765。
Engler等人，ACS Synth杂志2014.2月5日(Web);DOI: 10.1021 / sb4001504。
进一步阅读Nicola Patron的MoClo工具包她的植物合成生物学研究，阅读Addgene的采访．
使用铂金栅极系统含有可变重复的工程缩略图
对优化TALEN装配和活动感兴趣?的Takashi Yamamoto的实验室在单链退火(SSA)试验中系统分析了TALE支架和模块对TALEN活性的影响，创建了一个完整的TALEN组装系统。
这个新白金门TALEN套件采用4个组件的组装系统，减少了单个重复可变二残基(RVD)组件质粒的数量，同时提高了第一次金门反应组件组装的成功率。虽然这种dna结合的特异性是通过TALE重复序列中12和13残基的RVD传递的，但人们发现TALE重复序列中其他自然发生的变异，称为“非RVD变异”，可以提高TALEN的活性。铂门系统中模块质粒的每个位置组(如p1HD、p1NG、p1NI和p1NN)在TALE重复的第4和32个残基处包含一个相同的变量重复(VR)，而VR在位置组之间是不同的。由于最佳的支架可以依赖于目标序列之间间隔区域的长度，因此提供了8个最终目的地载体，包括两个不同的TALE支架中的所有4个最终RVD模块。这些更新的TALEN基因组工程证明了提高效率比以前的报告。
有关使用Platinum Gate Talen Kit的其他信息，请参阅山本实验室的协议取得建设。
佐久间et al .,Sci代表．2013年11月29日; 3：3379。
对更多的基因工程技术感兴趣吗?浏览其他Addgene的基因组工程指南．
射击那些神经元：mgrasp
《自然》杂志2012年的一篇文章固定绞车金同事描述了他们努力映射鼠标脑中突触的位置和分布。Kim等人正在利用哺乳动物掌握（跨突触伴侣GFP重建）技术，基于两个非荧光分裂GFP片段之间的功能互补。当在不同神经元的一个神经元和突触后区域的突触前区域表达的两个片段中，在突触裂缝中邻近，功能荧光GFP在体内重构。目前从Kim Lab获得的是2个突触前和2个突触后瞄准mGRASP质粒．此外，该实验室最近描述了另一种用途一组mGRASP质粒在2014年的Neuron论文中．
下一代Brainbow神经元成像工具包
约书亚洗车他在哈佛大学大脑科学中心的团队开发了一个下一代大脑彩虹工具包用于单个神经元的高分辨率荧光成像。该技术通过表达随机生成的荧光蛋白混合物，为种群中的每个细胞产生独特的光谱识别，这是由基因水平上的竞争重组事件决定的。vwin德赢娱乐平台在Cre/loxP重组后，每个转基因表达三种可能的荧光蛋白之一，选择最小的光谱重叠，最小的蛋白聚集和高的光稳定性。vwin德赢娱乐平台当多个磁带集成时，每个磁带都独立重组，产生数十或数百种可能的组合(取决于副本的数量)。这有助于在成像应用中区分邻近细胞，并将神经元投射映射到相关的细胞体。
的“彩虹”系统的第一版在2007年被报道。为了扩大该系统的实用性，研究人员开发了三个新版本。Flipbow采用Flp重组酶/FRT系统代替Brainbow的Cre/loxP，允许在同一动物的不同组织中同时使用这两种系统。Flipbow还在FP序列中加入了SUMO标签，用于从基于creb的表达brainbow的细胞中分离。Autobow质粒是一体化的版本，表达自切Cre重组酶，来自与Brainbow盒相同的转基因，当额外的杂交步骤不希望或不可行时，简化实验。最后，腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)系统能够对表达进行更大的时空控制，并增加Brainbow可用于的物种数量。该系统串联使用两个质粒，每个拷贝表达的cre依赖倒置在0到2 FPs之间。提供档案，扣环和自动系系统而Brainbow AAV受EF1a启动子控制。
pCoofy载体优化蛋白表达
在Sabine Suppmann马普生物化学研究所的重组蛋白生产小组已经开发了许多用于序列和连接独立克隆(SLIC)的表达载体。的pCoofy系列质粒含多种N-和c -末端标签(包括His、S-tag、OneStrep、CBP、Trx、GST、Halo、MBP、NusA和SUMO)，用于优化表达、溶解和纯化，并已在细菌、昆虫和哺乳动物细胞中进行了测试。这些载体设计为平行测试和筛选构建在多个宿主细胞，以优化表达。一个给定物种的表达质粒基于相同的主干，允许表达水平在不同的标签之间直接比较
为了克隆感兴趣的序列或基因进入PCOOFY载体中，从表2中选择适当的载体和基因引物相关的出版物其中包含载体与SLIC基因引物之间序列同源的区域。在SLIC克隆中分别扩增pCoofy载体和目标基因序列，以重组形成所需的载体。pCoofy载体中含有ccdB盒，在PCR扩增过程中不复制ccdB盒，因此在SLIC克隆后，只保留了所需序列的载体。相关出版物中描述的一般克隆策略可用于生成任何标签组合，以快速、高效和负担得起的方式优化蛋白质表达和纯化。
Scholz等BMC生物技术．2013年2月14日; 13：12。
植物转基因的GreenGate克隆系统
开发的Jan罗曼和同事，Greengate是一种克隆系统，用于植物转化构建的快速组装。顾名思义，Greengate基于Golden Gate克隆方法，但已被修饰，特别是改善植物转发。的GreenGate试剂盒可在Addgene包括基于pUC19的进入载体和基于pGreen-IIS的目的载体中预先克隆的6个独立插入模块(植物启动子、n端标签、感兴趣基因编码序列、c端标签、植物终止子和植物抗性盒)。
要了解有关绿色克隆系统的更多信息，请参阅详细质粒试剂盒页面或者阅读我们的博客文章:快速，通用的植物转发与绿酸盐质粒．
Lampropoulos et al .,普罗斯一体．2013年。12月20日; 8（12）：E83043。
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