分析和排除Sanger测序结果的6个技巧

本博客最初发表于BitesizeBio这里。

我的工作之一就是保证质粒的质量Addgene我每周分析50-100个测序反应。因此，我养成了一些好习惯，我想传给你们，以确保你们从测序运行中获得的数据中得到最大的好处。

当你对凝胶进行限制消化时，你总是要包括适当的控制，如未切割的DNA和适当的阶梯。这些控件可以帮助您正确地可视化您的结果。其中最重要的是总是仔细查看从您最喜欢的测序设备获得的测序结果的跟踪文件(或色谱图)。

当涉及到DNA测序时，色谱图就是你的视觉控制。就像所有的控制一样，错过是一个巨大的错误。

色谱图可以帮助你分析和排除DNA测序结果

上面(这篇文章的右上角)是一个看起来干净的DNA序列的例子(没有看到n)。如果你从来不看痕迹你就会幸福。

但是仔细看，色谱图上的重叠峰表明结果并不像序列所显示的那样确定。事实上，这是如此模糊，DNA测序反应应该重复。

帮助DNA测序故障排除和分析的指南

1.您可以使用以下任何程序来查看您的.ab1色谱文件

• 4的山峰(Mac)
• SnapGene查看器(Mac / PC)
• FinchTV(Mac / PC)
• 顺序扫描(PC)
• 浓度(PC)

2.您应该看到单个的、清晰的、均匀间隔的山峰

这样的……

3.期望得到500-700个碱基的干净可靠的DNA序列

如果少于这个量，你可能会怀疑你的样本有污染，或者考虑要求你的测序设备对一个困难的模板应用特殊的协议。再多一点，你就进入了不确定的领域。

4.永远不要相信DNA测序的前20-30个碱基

这里的峰值通常是未解决的和小的，所以我建议设计引物至少在目标序列上游50bp。

5.使用硅旋转柱纯化你送去DNA测序的样本

如果您的测序设备要求您进行自己的Big Dye PCR扩增反应(而不是使用一些公司提供的全部服务)，您可以通过醋酸钠/异丙醇沉淀法或使用多个供应商提供的硅旋柱来纯化产品。沉淀法有一个不幸的副作用，会搞乱70-75碱基附近的反应(见下图)，所以我强烈建议使用硅旋转柱。它们可能很贵，但很值得。