基于CAS9的基因组编辑系统,所有大肠杆菌菌株

由Guest Blogger.

这篇职位由四川师范大学的讲师齐莉,q泽,杨实习生,杨阳,中国科学院综合生物学教授的j泽·张张。

pas /pTargetF系统是目前最流行的基因组编辑系统之一E科利。根据Addgene、MolecularCloud和我们实验室的数据,总共分别有723条和615条使用pCas和pTargetF的记录。然而,一些用户指出,该系统在E科利pTargetF转化到BL21(DE3)/pCas菌株后,转化子BL21(DE3)无法生长。中国科学院实验室优化了pCas/pTargetF系统,并将其更新为pEcCas/pEcgRNA系统。的工作”一种用于crispr - cas9辅助大肠杆菌基因组编辑的改进的pCas/pTargetF系统“在2021年3月25日在Acta Biochimica et Biophysica Sinica发表。

原始PCAS / PTargetf系统

我们的原始PCAS / PTargetf系统由一个质粒组成,表达年代pyogenes.Cas9,一个温度敏感的自固化复制子,阿拉伯糖诱导lambda-red.基因,以及靶向PTargetf上PMB1复制品的IPTG诱导的SGRNA序列。除PMB1复制品外,PTargetf还包含针对感兴趣的基因组位点的SGRNA。供体模板单独提供。

要使用该系统,您首先将SGRNA序列介绍到PTargetF构建体中,然后将两种质粒引入细胞中。现在可以进行染色体中的编辑。编辑后,通过诱导靶向PMB1复制子的SGRNA表达可以从细胞中治愈ptargetf,导致切割质粒。

此时,可以使用随后介绍包含另一个针对另一个感兴趣站点的SGRNA的Ptargetf介绍。一旦您想要所有的编辑,通过在37°C时生长细胞来固化PCAS9。

新的pEcCas/pEcgRNA系统

在目前的研究中,我们推测PCA的GRNA对PTargetf的PMB1复制子特异性的GL20在BL21(DE3)中可能表现出更严重的泄漏表达,我们假设由CAS9削减引起的PTargetf。这将导致缺乏回收的转化体。我们的投机激励我们更新PCAS / PTargetf系统。

将Pecgrna和Peccas转化为大肠杆菌的原理图以编辑基因组。随后从细胞中固化质粒。
图1:编辑过程从添加pEcgRNA中的sgRNA序列开始。接下来,这两个质粒在大肠杆菌中与供体DNA进行转化以进行编辑。然后从细胞中提取质粒。步骤1-1和1-2可以同时进行。从图片李等人。,2021

更新涉及以下更改。在pCas9中,我们1)用PrhaB取代gRNA-pMB1的启动子,2)将pCas的复制子变为非温度敏感的复制子,3)添加sacB基因进行反选择产生佩奇。在Ptargetf中,我们用含有在其末端的Bsai限制酶位点的CCDB基因取代了PtargetF上的原始20bp特定序列Pecgrna.。这CCDB用作计数标记并将被瞄准基因组位点的sgRNA所取代。

我们将pCas/pTargetF系统与更新的pEcCas/pEcgRNA系统进行了比较,证实gRNA-pMB1确实在BL21(DE3)中有稍高的漏表达,导致pTargetF系列质粒的转化效率较低。幸运的是,我们使用新生成的pEcCas/pEcgRNA系统成功地删除了BL21(DE3)中的相关基因。

从Addgene获得更新的pCas/pTargetF质粒!

pEcCas/pEcgRNA系统的优点

与原系统相比,pEcCas/pEcgRNA有以下几个方面的优势:

  1. pEcCas质粒可在37℃下快速生长E科利sacB基因的加入有利于质粒清除。
  2. 更新pEcgRNA质粒上的间隔层(20nt)更方便,因为只需要两个24 nt寡核苷酸,BsaI线性化的pEcgRNA主链可以大量制备并冷冻备用,或者直接与退火后的24 nt寡核苷酸连接生成新的pEcgRNA。
  3. pEcCas/pEcgRNA不仅可以应用于大肠杆菌K-12菌株,也可以应用于大肠杆菌中E科利B和W株。
  4. 优化的质粒固化方法更简单,仅服用〜32小时而不是〜60小时。

我们成功地测试了pEcCas/pEcgRNA系统在4E科利K-12菌株,2E科利B菌株,1E科利菌株和1Tatumella Citrea.,共编辑了70个站点。我们优化了质粒固化的策略,为用户提供了完整的编辑过程。如果您已授予此系统尝试,我们很乐意听到您的反馈!


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Qi-Li-min李琪于2019年在中国科学院分子植物科学卓越中心获得博士学位。同年加入四川师范大学生命科学学院,任讲师。主要研究微生物基因组编辑逃逸机制,可用于优化基因组编辑工具。

杰泽 - 张敏杰泽张是一名学生在南加州大学学习生物化学的本科生。他也是自12月20日以来分子植物科学院杨氏实验室的实习生。他的研究侧重于细菌中转座子编码的CRISPR / CAS系统的效率,特别是优化低效率的菌株。

盛阳照片

杨胜,博士,毕业于中国科学院上海生物化学研究所。他于2000年加入上海生物科学研究所,并于2006年成为合成生物学教授。实验室的研究重点是开发微生物基因组编辑工具,以更快地构建或重新编程的细胞,以了解其独特表型背后的遗传和生物化学机制,并设计新一代工程细胞的绿色化学和生物医学应用。

参考资料

参考:

江y,陈b,段c,sun b,阳j,阳s(2015)多尾编辑大肠杆菌基因组通过CRISPR-Cas9系统。应用环境微生物81:2506-2514。https://doi.org/10.1128/aem.04023-14

关键词:crispr - cas9, pTargetF,基因编辑,转录因子大肠杆菌。生物化学学报,生物物理学报。https://doi.org/10.1093/abbs/gmab036

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