选择B(右)EST荧光蛋白的实用方法

由Guest Blogger.

这篇职位由Guest Bloggers Joachim Goedhart和Marieke Mastop来自阿姆斯特丹大学的分子细胞学和van Leeuwenhoek中心。

在您决定购买哪辆车之前,值得测试一对候选人是值得的。在购买新显微镜之前,它可以智能地查看(和通过)几种型号。在您开始新项目之前vwin德赢娱乐平台,最好的建议是尝试几个有希望的型号来检查它们的表现方式你的实验条件。这是花了很好的花费,如果你这样做,可以是(部分)你的下一篇论文或论文的一部分。这一系列帖子解释了如何批判性地评估荧光蛋白的报告性质,如何进行荧光蛋白的头部对比较以及如何对最佳荧光蛋白做出明智的决定vwin德赢娱乐平台你的应用。

选择特定应用的最佳荧光蛋白似乎是令人生畏的任务。许多荧光蛋vwin德赢娱乐平台白可用,荧光蛋白的数量稳定地增加。通常,荧光蛋白的选择基于文献或制表数据中的特性,总结了网站上荧光蛋白质的性质。vwin德赢娱乐平台为了使最佳选择,需要在相关条件下仔细审查荧光蛋白质。

荧光蛋白的性质通常仅在少数条件下检查vwin德赢娱乐平台,因为不可能检查生物和设备的所有可能组合。因为荧光蛋白的性能强烈取决于生物系统以及成像方法,我们建议在最佳模仿预期应用的条件下基于小规模的头脑比较研究。在这一系列帖子中将治疗的活细胞成像的三个关键属性是(i)亮度,(ii)光稳定性(iii)聚集趋势。

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亮度

亮度是指荧光分子的荧光强度。更高的亮度增加了检测到的信号,因此高亮度是荧光团的重要特征。关键问题是如何最好地定义或确定亮度。在这里,我们将解释如何确定实际亮度,为什么实际亮度是比选择最亮荧光蛋白的理论亮度更好的标准。

理论亮度

确定亮度的荧光团的两个关键特性是激发光被吸收的程度,并且吸收光子被转换成发射的光子的效率。这些由消光系数(EC)和量子产率(QY)表示。通过QY乘以EC(EC * Qy,有时标准化为EGFP的值,计算理论亮度。数量越高,理论亮度越高。理论亮度通常出现在具有荧光蛋白质特性的表中,并提供了比较荧光蛋白的快速方法,例如,vwin德赢娱乐平台看Chudakov等人(2010)Cranfill等人(2016)或者荆棘(2017)。然而,理论亮度忽略了与成像策略和样品有关的几个重要实验条件。

实用亮度

具有高固有亮度的蛋白质,其在显微镜设置中不折叠或不能检测到零的实际亮度零,并且没有使用。因此,更明智地比较荧光蛋白基于您的实际建立中的实际亮度。vwin德赢娱乐平台实际亮度考虑所有申请特定参数,包括显微镜(激发波长,可用发射滤波器和检测器灵敏度)和生物系统(温度,原核生物与真核生物,背景荧光)的规格。

确定实际亮度

当哺乳动物细胞的盘子瞬时转染含有质粒的质粒荧光蛋白(融合)在盘中的单个哺乳动物细胞的荧光强度存在巨大变化。这是由细胞上的质粒摄取的随机性质引起的。为了纠正这种变化,参考荧光蛋白在等级(Goedhart等,2011年)可以使用。

分析在我们的实验室中开发使用由相同的开放阅读框架翻译的参考蛋白,并通过感兴趣的蛋白质分离2A自切割肽Goedhart等,2010)。测定的说明在图1中描绘。感兴趣的荧光蛋白与参考蛋白质之间的严格相关性(Goedhart等,2011年)允许在现实的实验条件下精确测定细胞中的亮度。通过在相同条件下确定一组荧光蛋白(具有相同的参考蛋白)的亮度,可以进行实际亮度的排名(vwin德赢娱乐平台Goedhart等,2012年Bindels等人,2017年)。用于将Mvurquoise2共同表达Mvsus作为参考蛋白的质粒可从addgene.

基于细胞的测定以确定实际亮度

另一种躲避哺乳动物细胞中观察到的细胞变异的方法是标记内源基因。通过成像细胞(或组织),其产生标记用荧光蛋白的内源蛋白质并用另一种荧光蛋白重复蛋白质,可以进行实际亮度的排名。该策略已在酵母中使用Lee等人(2013)和线虫的El Mouridi等(2017)Heppert等人(2016)。在哺乳动物细胞中,这是可能的CRISPR / CAS的基因组编辑

选择明亮的荧光蛋白

从两个橙色荧光蛋白上的实际亮度测定获得的数据vwin德赢娱乐平台实际亮度考虑了所有实验条件。特别地,宿主细胞中荧光蛋白的折叠和成熟效率,这是实际亮度的关键决定因素。因此,实际亮度提供了比理论亮度在“真实”的应用中所期望的更好的图像。因此,鉴定一些有前途的荧光蛋白质并确定并比较它们在密切模仿未来应用的系统中的实际亮度。vwin德赢娱乐平台在图2中,我们提供了两个橙色荧光蛋白的实际亮度的比较的例子,仅通过单个氨基酸不同。vwin德赢娱乐平台无需进一步的有关照片的属性或聚集趋势,我们的选择将是MKOK-2A-MTQ2;它比聪明更亮MKO2-2A-MTQ2.根据这个数据。实际亮度测定(使用共表达荧光蛋白或使用内源标记基因)可用于验证在不同的成像条件下的性能(例如不同的发射过滤器)或vwin德赢娱乐平台不同的设置。

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非常感谢我们的客人博客Joachim Goedhard和Marieke Mastop!

joachim goedhart爆头Joachim Goedhart是一部位于阿姆斯特丹大学的分子细胞学和van Leeuwenhoek中心的助理教授。他开发,特征,使用遗传编码的荧光探针。你可以在推特上关注他:@joachimgoedhart.

Marieke Mastop爆头Marieke Mastop是在分子细胞学(阿姆斯特丹大学)的博士学位候选人,在那里她开发了基于遗传编码的基于FRET的生物传感器。

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