AAV:一种用于哺乳动物基因表达的多功能病毒工具

由Guest Blogger.

这篇帖子由Guest Blogger Didem Goz Ayturk撰稿,该帖子在康迪科斯科在哈佛大学医学院的康涅狄格州实验室博物馆博士,来自Addgenie Karen Guerin的编辑。

腺相关病毒(AAV)已成为研究和临床应用的最喜欢的病毒工具。AAV可用于瞬时表达各种细胞类型的感兴趣的基因。它是大约50年前描述的作为腺病毒制剂的污染物,因此名称(阿蒂森等人。,1965年) AAV是一种单链DNA病毒,属于细小病毒科。它有一个包装在二十面体衣壳中的“简单”基因组。它没有脂质涂层,也称为包膜,因此不能支持糖蛋白的添加,如VSV-G,到其表面。在研究应用中,基因组通常被掏空,以便为基因传递和安全打开宝贵的空间。在组织培养环境中,通过提供编码复制酶功能和衣壳蛋白的基因,你可以很容易地对病毒进行补充,换句话说,“反式”补充。这使研究人员能够在可控的环境下产生更多的病毒。尽管AAV从广泛的生物体中分离出来,但它尚未与疾病相关,而且它被认为是一种生物安全一级(BSL1)病毒因子。

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完美重组AAV (rAAV)工具的四个考虑因素

AAV可以被广泛应用,包括特定细胞类型的瞬时基因表达,CRISPR基因组编辑,光遗传学, 和化学物质实验。如果您是新的ravs作为基因交付工具,请在入门前有一些您应该考虑的事情:

货物能力

即使是RAAV的GUTTED版本也具有〜4.7 kB的货物能力,这是基因递送病毒的关键局限之一。但是,如果您的感兴趣的基因足够小,则可以使用包装的两个基因设计单个rAAV载体,并使用如此忿怒或2,从一个启动子共同表达他们。如果滴度高,则不同rAAV的共同感染率也很高,所以如果你不能在一个向量中适合你的基因,你可以投入(虽然这可能并不总是有效的工作体内)。

2.特异性

有几种不同的rAAV成分可以驱动特定细胞/组织中的基因表达;其中包括启动子,flp或克瑞斯依赖性基因交换机和血清型(血清型将在下面讨论)。如果您的目标是广泛的表达,宽敞的促进者,如CAG(鸡饼型肌动蛋白启动子与CMV即时早期增强剂)是一个不错的选择。如果您有特定的目标单元格类型,则可能需要尝试不同的推动者,例如,CAMK2A用于神经元特异性。另一方面,具有CRE-或翻盖依赖性基因表达的rAAV载体可以用CRE或FLP注射到具有特定细胞类型中的CRE或FLP的动物,导致这些细胞中的基因表达。

3.血清型

衣壳蛋白是非常重要的rav矢量组分,并驱动这些载体的生物学。虽然多项研究表明,不同的血清型在其感染不同细胞类型的能力方面不同,但最近的一项研究表明,大多数(或全部)血清型使用相同的受体(AAVR)(皮莱等人,2016年)。观察到的热度可能是由于其他因素,例如将病毒粒子与细胞表面的附着,或者在进入之后可能的步骤,例如未涂覆。

AAV命名法可能会令人困惑。您可能会看到AAV2 / 2或AAV2 / 8等名称,但这些数字实际上是什么意思?第一个数字代表反转终端重复(ITR)类型。ITRS是侧翼AAV基因组的短DNA序列,并使其形成宿主细胞中的联系。除了REP蛋白外,它们促进在染色体19上的AAVS1位点上融入人类基因组,只用野生型AAV观察到的东西 - 不是矢量形式。几乎所有向量包含2型ITR。类型2 ITRS可以用各种吊桥类型打包。用于封装RAAV载体的衣壳类型,即血清型 - 用第二个数字表示。例如,如果RAAV向量具有2型和第8型衣壳的ITR,则它将表示为AAV 2/8。

4.基因组

野生型AAV是单链DNA病毒。在未涂覆DNA之后,病毒依赖于宿主细胞复制机械以合成互补DNA链。该步骤被认为是RAAV的转导效率的限制因素。克服这一点,(麦卡蒂等,2001年)通过突变其中一个ITRS来设计一个二聚体或自互补的AAV(称为SCAAV)。SCAAV向量显示比SSAAV快速发作(天)和更高级别的转换表达。然而,它们的包装能力(<2.5KB)是SSAAV(<4.8KB)的一半,限制可以成功包装的基因数和监管元素的数量。

如果需要快速的转基因表达,caav可能是有价值的。较低的效价可以达到所需的转基因表达水平,减少由于高病毒粒子浓度而出现毒性或免疫原性的机会。

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ssAAV和caav基因组的比较

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简而言之,您首先通过携带感兴趣的基因的RAAV载体来转发HEK293T细胞,腺病毒辅助质粒和含有质粒的批量和帽(图2,通常称为“三重质粒转染”)。2-3天后,收集上清液,(或在某些情况下,将细胞提取物制成细胞提取物,因为一些RAAV血清型被释放到培养基中,而其他rAAv血清型在其他人不是)(Vandenberghe等人,2010)用PEG沉淀病毒粒子。然后用高速超离心机通过密度梯度离心进一步纯化病毒粒子。病毒粒子会形成一个带由于它们的高密度,你可以从梯度收集这个带。然后通过透析/缓冲液交换去除密度梯度物质,如果需要可以进一步浓缩病毒粒子。

使用靶向病毒基因组的引物和/或蛋白质凝胶可以通过QPCR滴定病毒赛准备。和/或蛋白质凝胶(Veldwijk等人,2002)。这些滴度用于物理粒子,其中许多是不传染性的。物理颗粒与传染性颗粒的比率可以大大变化,从1-100到100。

AAV病毒粒子非常稳定。它们可以经受冻融循环和脱水,这使得之前可能在你的长凳上、离心机里或孵化器里的准备物污染成为可能。为了减少这种情况,您应该用消毒剂处理所有与AAV接触的一次性物品和表面,例如Coverage Plus NPD。也很重要的是努力应用常见的细胞培养方法。

rAAV生产示意图

体内rAAV交付

AAV交付有几个因素体内这取决于你的生物系统。这些因素在很大程度上影响你感染的成功率。无论你的申请是什么,下面列出的一些参数是你在继续注射之前需要考虑的:

注入效价

可以输送到组织中的病毒颗粒的数量取决于病毒制剂的滴度和可以输送的最大体积,这是非常重要的。不幸的是,如上所述,物理粒子的滴度不能直接转化为你将观察到的东西体内尽管这是一个起点。你可以从查阅有关特定组织的文献来寻求建议,但通常情况下,最佳剂量需要根据经验来确定体内尝试一系列稀释液。

animal

首先,重要的是要记住,最终分化细胞(即有丝分裂后细胞)将有长期的AAV表达,但在分裂细胞中,表达将丢失。被注射动物的年龄将决定你能成功感染哪种细胞。(即在发育早期,尚未出生的细胞,即使存在有丝分裂祖细胞,也不会被AAV感染)(熊和Cepko, 2016)

可视化感染

在开始交付过程之前,您还应该考虑如何在rav感染之前进行可视化。你有没有在你的rav构造中包括报告基因,例如绿色荧光蛋白或mCherry?这些将使在通过荧光测量发生的情况下,可以轻松地观察到表达式。如果没有,您可以考虑共同注入一个AAV,该AAV在与您感兴趣的基因驱动您的感兴趣和测量报告基因表达的同样的启动子下,作为您感兴趣的基因,这可能不易检测。如果是不可能的共同表达或共感染,请通过免疫组织化学或通过免疫组织化学检测蛋白质现场杂交可能是你最好的选择。

感染后的时间

足够量的时间需要通过注射和组织处理以检测AAV介导的基因表达。定时将高度依赖于衣壳类型和您感染的组织。等待〜2周是许多组织的良好起点。据报道,AAV介导的基因表达是非常稳定的,持续在人类临床试验和狗的几年(Wonjo等人,2013)。

准备AAV时的考虑因素:

在设计和增长之前 交货及之后
货物能力 管理滴度/体积
推动者(具体对方) 动物时代
血清型-组织/细胞向性 可视化感染
生产(DIY或购买?) 感染后的时间

AAV是一种极其多功能的病毒基因递送工具。您特定研究应用的需求将确定AAV设计和交付的适当参数。虽然您的最终血清型/滴度/年龄确定将大量依赖试点实验,但您可以向不断增长的文献中寻找适合许多不同生物系统的设计建议。在过去二十年中,涉及AAV的一百多个临床试验,似乎在未来几年内,此工具将在治疗和基本研究环境中仍然受欢迎。


非常感谢我们的博客,Didem Goz Ayturk!

didem goz ayturk.Didem Goz Ayturk是Connie Cepko实验室的博士后研究员,利用病毒工具研究视网膜的神经元回路。

参考

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3.McCarty,D. M.,Paul E. Monahan和Richard J. Samulski。“自我互补的重组腺相关病毒(SCAAV)载体促进了DNA合成的有效转导。”基因治疗8.16(2001)。PubMedPMID: 11509958

4. Vandenberghe,Luk H.等。“在腺相关病毒制造期间”高效血清型依赖性释放功能载体中的培养基。“人类基因治疗21.10(2010):1251-1257。PubMedPMID:20649475.。公共医学中心PMCID:PMC2957237.

5. Veldwijk,Marlon R.等人。“基于实时定量PCR的滴定法的开发与优化AAV-2股票滴定”。分子治疗6.2(​​2002):272PMID: 12349826

6.熊,文军和康斯坦茨·佩皮克。“AAV8载体的明显表达模式,具有来自尺寸激活的促进剂,其两种不同年龄不同的新生儿小鼠眼睛。”视网膜退行性疾病。Springer International Publishing,2016. 501-507。PubMedPMID:26427452

7。冈田,Takashi。高效的AAV矢量生产系统:对Duchenne肌营养不良的基因治疗。Intech Open Access Publisher,2013。Intech网页

8.Wojno, Adam P, Eric A. Pierce和Jean Bennett。“看到了光。”科学转化医学5.175 (2013): 175 fs8 - 175 fs8。PubMedPMID:23467559.

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