切换到GECO?AAV编码钙传感器的概述

由Leila Haery

Leila Haery.

作为我们与之合作的一部分宾夕法尼亚州矢量核心,我们将扩大我们对钙感测的工具库存。在此帖子中,我们将查看我们可用的主要类别的传感器。

为什么监测钙?

监测大脑活动的一种方法是监测钙动态。在神经元中,动作电位时钙通道被激活,导致细胞质中钙水平短暂(约100毫秒)增加(称为钙瞬变)(Helmchen等人,1996;Koester和Sakmann,2000;Hille,2001)。真核细胞的细胞质中游离钙的浓度约为100nm,并且在动作电位期间上升到微摩尔范围(Wadel等人。,2007年)。因此,钙水平是神经元激活的代理(Broussard等人。,2017年)。

使用钙作为神经元活动指示剂的主要局限性是其量也由其他生物处理调节,其速率可以根据细胞类型变化。因此,根据上下文,对来自钙水平的活动的推迟可以变得复杂(Badura等人。,2014年)。

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单通道钙指示器

钙传感器在钙结合时荧光单波长传感器基于单个vwin德赢娱乐平台荧光强度随着钙结合的变化而变化。这些传感器测量在一个波长,通常把“上/荧光”钙存在和结合检测器时,“关闭”当钙缺失和不绑定到传感器(图1)。基本上,一旦传入大脑,你可以看到这些传感器活跃的神经细胞。当神经元变得不活跃时,钙水平恢复正常,传感器关闭。换句话说,这些传感器是可逆的,这意味着钙可以从它们分离,这使传感器回到其关闭状态。

钙脱离传感器的速度如何尤为重要,对于测量不同类型的细胞信号传导。例如,对于钙具有更高亲和力的传感器需要更长的时间在钙水平恢复正常后关闭。这些传感器不擅长感测频繁事件,但足够敏感以检测从较少数量的动作电位产生的钙水平。

已经开发出具有整体亮度,开/关动力学和钙亲和力差异的单波长传感器,并且基于这些性质,适用于各种应用。这些变体如下所述。

在Addgene中找到AAV钙生物传感器矢量

jGCaMP6:

参考:Chen等人,2013

GCAMP指示器是一些最流行的钙传感器(并且已经通过各种迭代,直到当前的JGCAMP-X))。GCaMP指标是基于改性GFP,钙结合蛋白(钙调蛋白,钙调)和M13肽。在结合钙后,CAM经历了改变GFP发色团的构象变化,导致GFP亮度增加。因此,可以使用沟槽指示器实时指示钙水平。Gcamp变体具有一定范围的开/关动力学,可用于测量不同类型的细胞活动。具体地,最快的变体(GCAMP6F)具有2.6倍的CA2 +亲和力(下kd)而不是慢变种(GCAMP6S)(表1)。结果,GCAMP6F具有比GCAMP6S更快的上升时间和衰减时间更快的4倍。更敏感,GCAMP6S能够检测小鼠中的99%的单一动作电位体内与GCaMP6f相比,GCaMP6f能够在84%的时间内检测单个动作电位。

表格1。用于单动势的GCAMP6动力学概述体内,小鼠V1(改编自Chen et al., 2013)

变体 改变荧光真实性休息 衰变时间(1/2), 小姐 上升时间(顶峰), 小姐
Gcamp6s. 23±3.2% 550±52. 179±23.
GCaMP6m 13±0.9% 270±23 80±7.
GCaMP6f 19±2.8% 142±11. 45±4

JGCAMP7(即将推出):

参考:Janelia研究所

可以从jcamp传感器的最新迭代道格拉斯金和Janelia研究所。这些GCAMP7传感器所有的信号幅度都比GCAMP6更大的信号幅度响应到单个动作电位刺激。各个传感器的优点如下(请参阅此处的数据):

  • jGCaMP7s- 是对动作电位的最敏感的响应者(对于单个动作电位,GCAMP7S相对于基线荧光,GCAMP7S大约是亮度的两倍,作为GCAMP7F变体,大约比GCAMP6亮大约5倍。)

  • jGCaMP7f -是最快的响应变体。

  • jGCaMP7b- 展示最亮的休息荧光,可用于成像小神经元过程(树枝状和轴突)。

  • jGCaMP7c-表现出荧光峰值和静息荧光之间的高对比度(通过降低传感器静息荧光,同时保持高荧光峰值来实现),由于不活跃神经元的背景荧光减少,因此有助于成像大量密集标记神经元的信号活性。这种变体有大约12倍的亮度增加后~100动作电位。它的亮度是GCaMP7f和GCaMP7s的两倍。

虽然有用,但Gcamp蛋白受到其绿色的限制。它们的激发和发射光谱的波长散射并损坏组织,限制了成像深度体内。为了解决这些限制,开发了基于类似架构的基于红色的钙指标(参见JRCAMP1A,B和JRGECO1A)。

红色指标的一个优点是能够在GFP小鼠系中或在表达其他基于GFP的工具的小鼠中复用。在这种情况下,可以独立于其他基于gf的工具来测量红色指标。相对于绿光成像,红光成像通常也可以成像更深的组织,并且可以用更少的激发功率(Rose等人,2014)。这是因为光散射与波长成反比,其既适用于激发和发射灯。

jRCaMP1a, b:

参考:Dana等人,2016年

这些是基于mRuby的红钙指示器。jRCaMP1a和jRCaMP1b的敏感性低于jGCaMP6,但没有显示光电开关在使用蓝光照明后(如jRGECO1所做的)。由于一些常见的光遗传学工具(例如,Channelrhodopsin, ChR2)是被蓝光照射的,因此jRCaMP1a, b对这种光的稳定性使它们适合于结合钙成像和光遗传学的实验。jRCaMP1a和jRCaMP1b也在稍长(更红色)的wav下运行与jRGECO1a相比,jRGECO1a能够提供更清晰的成像(参见上面关于散射的说明)。

jRGECO1a:

参考:Dana等人,2016年

这是基于Mapple的红色钙指示器,其对JGCAMP6具有可比的敏感性。基于Mapple的GECIS,如R-GECO和R-CAMP 2,当用蓝光照射时,展示照片开关,导致红色荧光的瞬态增加,使其与其使用Optimetics工具(通常由蓝光激活)。

FRET-based钙指标

基于FRET的钙生物传感器与单波长传感器不同,烦恼基于钙传感器是基于两个荧光蛋白连接一个肽和钙结合域(如CaM或肌钙蛋白)。vwin德赢娱乐平台钙结合使FPs更紧密,提高了两种蛋白质之间的FRET效率。这样,基于freet的钙传感器可以通过两个波长(供体发射波长和受体发射波长)进行量化。

Twitch-2B:

参考:Thestrup等人。,2014年

Twitch指标包括两个由连接物连接的荧光蛋白(FPs)和肌钙vwin德赢娱乐平台蛋白钙结合域(图2)。在钙缺乏的情况下,Twitch形成一个拉长的结构,两个FPs之间的距离较远(~5.2 nm)。在钙离子的结合下,FPs相互靠近(~ 15Å),增加了供体和受体FPs之间的FRET效率。在Twitch2B (mCerulean3和cpVenusCD分别具有特别明亮的供体发射光谱的优点。

FRET-based钙指标具有比静止时单波长传感器更亮的优点,可以更好地在细胞中显示(Thestrup等人。,2014年),并且已被证明可以检测蜂窝室内的钙(拉塞尔,2011年)。然而,相对于基于freet的指标,GCaMP传感器的优势是对Ca响应的荧光变化更大2 +绑定(Russell,2011)。例如,在钙结合时,Twitch-2b在受体FP荧光中具有大约2倍的增加(TheStrup等,2014),而JGCamp6传感器显示出约10倍的动态范围(Chen等,2013)。

哎呀,我眨了眨眼 - 不可逆钙传感器的益处

当你实时观察大脑时,实时跟踪大脑活动的能力很大。但是,这些实时信号关闭,只能检测到它们的显微镜在它们激活的确切时间(其基本限制在显微镜的场)上,只能检测到它们。基本上,实时传感器具有使大脑活动长期检测的优势,而是仅在小区域中。另一方面,使用不可逆的钙传感器,可以在没有直接监测它的情况下检测整个大脑中的活动,但只有几秒钟。

Campari钙传感器金巴利:

参考:Fosque等人,2015

钙调制从可逆钙传感器可光活化的比例积分器(CAMPARI)不同,因为它在用户定义的时间段期间提供了钙活性的永久记录。该集成商仅通过从绿色转换为红色,仅在高钙水平和用户提供的紫光的同时,只能在具有高钙水平和用户提供的紫光的存在下(图3)。这种永久的转换提供了对大脑在用户指定的时间段的广泛领域的能力记录钙水平,并与钙离子浓度的红色荧光强度相关因素。Campari通过允许在大面积的细胞和组织中进行总钙活性测量来补充现有的钙指示剂。

底线

总的来说,现有的钙指标并不缺乏,但每种指标都有其优势和局限性。最佳指标将根据所测生物活性的类型而有所不同。


参考文献

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