AAV滴度:它们来自哪里，它们的含义是什么?

还记得游戏节目“25,000美元的金字塔”吗?在这个节目中，一个玩家列出属于某个类别的东西，试图让另一个玩家猜出属于哪个类别?好吧,让我们玩。我将列举一些例子，你试着猜测它的类别:

ELISA……
qPCR……
数字滴PCR……
DNA点污点……
转导化验……
sds - page……
电子显微镜……

猜测吗?

这是正确的…效价的方法AAV!

重点是有很多方法可以量化a的组成病毒载体解决方案，并且通常这些方法测量溶液的不同特性。这些特征给我们有关三个重要因素的信息。

AAV滴度能告诉你什么?

1. 物理效价：含有病毒基因组的病毒颗粒的浓度。通过量化病毒基因组的浓度来测量物理滴度（通过qPCR或其他DNA定量方法(见下文)，因为每个病毒粒子通常包含一个病毒基因组。除了一个理论的最大值，物理滴度并不一定给出任何传染滴度的指示。病毒载体原液的感染效价可以根据转导靶点而变化，也可以通过病毒溶液的冻融而改变(洛克等人，2010年)。

2. 传染性效价:可转导细胞的病毒颗粒的浓度。感染滴度通常通过细胞转导测定来定量。据报道，野生型AAV2具有近乎完美的物理与感染颗粒比例为1:1 (Zeltner等人。，2010年)。然而，对于重组AAV2，同样的研究报告了50:1的物理感染颗粒比例(Zeltner等人。，2010年)。病毒制剂的特异性感染性是由物理病毒颗粒与感染性病毒颗粒的比率确定的。
   
   
3. 含量为空病毒衣壳的比例：含基因组病毒颗粒的比例相对于病毒衣壳的总数（其可包括缺乏病毒基因组的空衣壳）。根据用于产生AAV的实验条件，可以在病毒生产期间形成空的病毒衣壳。一项研究表明，大约50％的病毒衣壳是含基因组（“完全”）（Zeltner等人。，2010年），而另一个报道，只有20％的重组AAV2颗粒均为满，与50％的野生型AAV2股（Grimm等人。，1999年)。含基因组的病毒衣壳的百分比通常通过病毒载体溶液的电子显微镜进行定量。由于这种技术是密集的，需要电子显微镜，它不是常规地用于所有新的病毒载体制备。Addgene使用这种方法对我们的病毒载体制备方案进行了总体验证，我们很高兴地报告，在代表性的病毒载体制备中，超过95%的病毒衣壳是含基因组的(图1)。
   
   *感谢哈佛大学纳米系统中心的David Bell和Svetla Stoilova-McPhie。

人们通常报告哪种效价?

Addgene和其他病毒载体生产设施报告了病毒溶液的物理滴度(图2)。因为物理滴度用于临床前研究的给药目的，理解这些值的含义以及如何进行比较是很重要的。

物理效价通常由两种常用的基于pcr的方法计算:

• 定量PCR (qPCR)
• 数字滴式PCR (ddPCR)

历史上，定量DNA杂交法(DNA点印迹法)已被用于测定AAV，但该方法目前尚未得到广泛应用(Fagone等人，2012)。

基于pcr的方法稳健、简单、快速、方便。然而，这些方法对AAV的定量并不一定精确或准确，因为PCR会受到很多实验因素的影响。下面列出一些量化AAV的复杂因素:

• qPCR的效率受AAV基因组二级结构的影响，主要是由于AAV基因组和itr的重复和自互补。
• 温度参数会影响qPCR的效率。例如，我们发现将PCR的退火温度从60°C - 61°C改善了测定可靠性。
• 不同的引物可以具有不同的退火效率（Wang et al.， 2013)。虽然您可以为每个单独的样本优化引物，但这会减少便利性和可比性，因为每个样本都可以用不同的引物对进行定量。
• 由于样品必须在标准曲线的线性区域内，因此PCR中起始物质的量不同，Ct值也不同。此外，高浓度和低浓度的样品在PCR中也可能表现不同，即使两个样品都在分析的线性区域内。这可能是由于引物与AAV基因组重复序列之间的结合位点竞争。
• 引物退火会受到蛋白质污染物的影响，这是AAV滴定的一个因素，因为起始模板是纯化的病毒载体溶液(包含病毒衣壳蛋白)，而不是纯化的DNA。这可以通过使用纯化的病毒DNA作为模板而不是完整的AAV粒子来减轻。
• 最后，测定的精度对最终效价的变化可能高达两倍，这只是由于测定的噪声。换句话说，重复相同的PCR两次可以得到两倍的滴度测量值。

我们如何得到更可靠的AAV滴度?

对于我们的病毒服务，我们目前用qPCR滴定AAV载体制备。为了确保准确和可靠的结果，我们在以下几个方面优化了我们的分析:

• qPCR的绝对定量需要生成已知浓度的标准曲线。我们定期制作并验证新鲜质粒标准品。
• 我们通过使用通用AAV参考标准材料（AAV SFM）验证我们的绝对量化，这是一个AAV样本，该样本已由世界各地的16个实验室量化，并且可以由研究人员使用来验证其QPCR测定（洛克等人，2010年)。除了AAV RSM外，我们还加入了已知滴度的第二个AAV参考样本，它的滴度比AAV RSM高。通过在我们所有的qPCR检测中使用这些样本，我们确保了生成的标准曲线是可靠的，因此可以用来准确地推断新的AAV样本的滴度值。
• 我们也通常通过两种qPCR方法来量化我们的AAV样本，并比较这些数值以确定准确性和可靠性。当这样做时，我们要判断两个效价值是否在测定的误差范围内，从而被认为是可靠的，或者样品是否需要再次定量。

qPCR滴定的一些问题得到了解决ddPCR技术(Hindson等人，2011,Hindson等人，2013）已被证明比QPCR更精确，更可重复（Taylor等人，2017)。然而，由于纯化的AAV制剂含有相似且低水平的背景蛋白和化学成分，ddPCR可能不是qPCR的改进(Taylor等人，2017)。

Addgene AAV滴度对你的实验意味着什么?

因为(物理)AAV效价是近似的，它们高度依赖于所使用的实验条件，所以不应该比较来自不同来源的样本的效价。如果在同一实验中使用不同来源的AAV，请考虑同时retitering AAV在您的实验室。绝对滴度值可能没有相对滴度值重要。最后，因为物理滴度不能给出感染滴度的指示，考虑滴定每批AAV在活的有机体内确定最佳用量。在Addgene，我们不保留大量的病毒，但如果您正在重新订购相同的病毒，请随时发邮件给我们，我们会尽最大努力发送给您一个特定的批次(如果我们仍然有)。

参考

1.Fagone, Paolo等人。自我互补腺相关病毒载体定量聚合酶链反应滴定的系统性错误和改进的替代方法vwin668人类基因治疗，B部分:方法23.1(2011): 1 - 7。PubMedPMID: 22428975。公共医学中心PMCID:PMC3640491。

2.D·格林等人。通过一种新的衣壳ELISA法测定AAV-2颗粒:基因组的包装可以限制重组AAV-2的生产。基因治疗6.7(1999)。PubMedPMID: 10455443。

3.Hindson, Benjamin J，等。“用于DNA拷贝数绝对定量的高通量滴式数字PCR系统”分析化学83.22(2011): 8604 - 8610。4.hinson CM, Chevillet JR, Briggs HA, gallichote EN, Ruf IK, Hindson BJ, Vessella RL, Tewari M.绝对定量滴式数字PCR与模拟实时PCR。Nat Methods. 2013 Oct;10(10):1003-5。PubMedPMID：22035192。公共医学中心PMCID: PMC3216358。

4.锁，马丁，等。“表征重组腺相关病毒2型参考标准材料。”人类基因治疗21.10（2010）：1273-1285。PubMedPMID：20486768。公共医学中心PMCID：PMC2957240。

5.Taylor, Sean C, Genevieve Laperriere和Hugo Germain。微滴数字PCR与qPCR用于低丰度目标的基因表达分析:从可变无义到发表质量数据。科学报告7(2017)。PubMedPMID: 28546538。公共医学中心PMCID：PMC5445070。

6.王峰等。一种可靠可行的定量pcr策略用于测定AAV载体。医学科学监测基础研究19(2013): 187。PubMedPMID: 23828206。公共医学中心PMCID: PMC3706409。

7.Zeltner，Nadja等人。“野生型AAV的近乎完美的感染性作为重组AAV载体感染性的基准。”基因治疗17.7(2010): 872 - 879。PubMedPMID: 20336156。公共医学中心PMCID: PMC2900506。

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