AAV滴度:他们来自哪里,他们的意思是什么?

由莱拉哈利

Leila Haery.

记住游戏显示“25,000美元的金字塔”,其中一个玩家试图通过列出落入该类别的东西来猜测一个类别?好的,让我们玩。我将列出这些示例,您尝试猜测该类别:

滴答人ELISA……
qPCR……
数字液滴PCR ...
DNA DOT印迹......
转导化验……
sds - page……
电子显微镜…

任何猜测?

这是正确的......替代的方式AAV.!!

重点是有很多方法来量化a的组成病毒载体解,一般这些方法测量解的不同特性。这些特征给我们提供了三个重要因素的信息。

AAV滴度能告诉你什么?

  1. 物理滴度:含有病毒基因组的病毒颗粒的浓度。物理效价是通过定量病毒基因组的浓度来测定的QPCR.或其他DNA定量方法 - 见下文),因为每个病毒颗粒通常含有一个病毒基因组。除了理论最大值之外,物理滴度不一定会给感染滴度的任何指示。病毒载体股票的传染性滴度可以基于转导靶数而变化,并且也可以通过病毒溶液的冻融改变(锁等人。,2010)。
  1. 传染性滴度:可以转诱导细胞的病毒颗粒的浓度。传染性滴度通常通过细胞转导测定量化。据报道,野生型AAV2具有近乎完美的物理到传染性粒子比为1:1(Zeltner等人,2010)。然而,对于重组AAV2,相同的研究报告了物理到传染性粒子比为50:1(Zeltner等人,2010)。病毒制剂的特异性感染性由物理病毒颗粒与传染病病毒颗粒的比率限定。

  2. 图1 AAV电子显微镜-01.png满衣壳与空衣壳的比例:含基因组的病毒粒子与病毒衣壳总数(包括没有病毒基因组的空衣壳)之比。空病毒衣壳可以在病毒生产过程中形成,这取决于用于产生AAV的实验条件。一项研究表明,大约50%的病毒衣壳含有基因组(“完整”)(Zeltner等人,2010),而另一项研究报告称,重组AAV2颗粒中只有20%是满的,而野生型AAV2库存中满的比例为50% (格林等人,1999)。含基因组的病毒衣壳的百分比通常通过病毒载体溶液的电子显微镜进行定量。由于这种技术是密集的,需要电子显微镜,它不是常规地用于所有新的病毒载体制备。Addgene使用这种方法对我们的病毒载体制备方案进行了总体验证,我们很高兴地报告,在代表性的病毒载体制备中,超过95%的病毒衣壳是含基因组的(图1)。

    *谢谢David Bell和Svetla Stoilova-McPhie,哈佛大学纳米级系统中心中心。

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人们通常报告哪种效价?

Addgene和其他病毒载体生产设施报告了病毒溶液的物理滴度(图2)。因为物理滴度用于临床前研究的给药目的,理解这些值的含义以及如何进行比较是很重要的。

来自addgene的aav等分试样

物理效价通常由两种常用的基于pcr的方法计算:

  • 定量PCR (qPCR)
  • 数字液滴PCR(DDPCR)

历史上,定量DNA杂交法(DNA点印迹法)已被用于测定AAV,但该方法目前尚未得到广泛应用(Fagone等人,2012)。

基于pcr的方法稳健、简单、快速、方便。然而,这些方法对AAV的定量并不一定精确或准确,因为PCR会受到很多实验因素的影响。下面列出一些量化AAV的复杂因素:

  • QPCR效率可能受AAV基因组的二阶结构的影响,由AAV基因组和ITR的重复和自互补引起。
  • 温度参数会影响qPCR的效率。例如,我们发现将PCR的退火温度从60°C - 61°C提高了测定的可靠性。
  • 不同的引物可以有不同的退火效率(Wang等人。,2013年)。虽然您可以针对每个单独的样本优化您的底漆,但这将降低便利性和可比性,因为每个样品用不同的引物对量化。
  • 由于样品必须在标准曲线的线性区域内,因此PCR中起始物质的量不同,Ct值也不同。此外,高浓度和低浓度的样品在PCR中也可能表现不同,即使两个样品都在分析的线性区域内。这可能是由于引物与AAV基因组重复序列之间的结合位点竞争。
  • 引物退火可以受蛋白质污染物的存在影响,这是AAV滴定的因子,因为起始模板是纯化的病毒载体溶液(含有病毒衣壳蛋白)而不是纯化的DNA。可以通过使用纯化的病毒DNA作为模板而不是完整的AAV颗粒来减轻这种情况。
  • 最后,测定的精度可以为最终滴度值变化至两倍,这是由于测定的噪音。换句话说,两次重复完全相同的PCR,可以给出改变到两倍的滴度测量。

我们如何得到更可靠的AAV滴度?

为我们的病毒服务,我们目前通过QPCR滴答AAV矢量准备。为确保准确可靠的结果,我们以几种方式优化了我们的测定:

  • qPCR的绝对定量需要生成已知浓度的标准曲线。我们定期制作并验证新鲜质粒标准品。
  • 我们使用通用AAV参考标准材料(AAV SFM)来验证我们的绝对定量,这是一份已经被全球16家实验室定量的AAV样本,可被研究人员用于验证他们的qPCR检测(锁等人。,2010)。除了AAV RSM外,我们还加入了已知滴度的第二个AAV参考样本,它的滴度比AAV RSM高。通过在我们所有的qPCR检测中使用这些样本,我们确保了生成的标准曲线是可靠的,因此可以用来准确地推断新的AAV样本的滴度值。
  • 我们也通常通过两种qPCR方法来量化我们的AAV样本,并比较这些数值以确定准确性和可靠性。当这样做时,我们要判断两个效价值是否在测定的误差范围内,从而被认为是可靠的,或者样品是否需要再次定量。

qPCR滴定的一些问题得到了解决DDPCR技术Hindson等人,2011Hindson等人,2013),该方法已被证明比qPCR (Taylor等人,2017)。然而,由于纯化的AAV制剂含有相似且低水平的背景蛋白和化学成分,ddPCR可能不是qPCR的改进(Taylor等人,2017)。

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Addgene AAV滴度对你的实验意味着什么?

因为(物理)AAV效价是近似的,它们高度依赖于所使用的实验条件,所以不应该比较来自不同来源的样本的效价。如果在同一实验中使用不同来源的AAV,请考虑固定AAV在您的实验室。绝对滴度值可能没有相对滴度值重要。最后,因为物理滴度不能给出感染滴度的指示,考虑滴定每批AAV体内确定最佳剂量。在Addgene,我们不保留很多,但如果您正在重新排序相同的病毒,请随时为我们发送电子邮件,我们可以尽力向您发送特定地段(如果我们仍然可用)。


参考文献

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