用于基因组编辑的腺相关病毒(aav)

由泰勒福特

泰勒福特

Guergger Todd Waldman,乔治城大学教授,为这篇文章做出了贡献。

AAV基因组编辑

adeno相关病毒(aavs)为简象基因表达制作奇妙的基因递送载体,特别适用于对神经系统的基因。多年来,它们也被用来提高基因组编辑的效率。在这篇文章中,我们将通过各种方式行走,您可以使用AAV来改善您的基因组编辑实验(有靶向核酸酶)。

AAV基因组编辑没有核酸酶

AAV基因组编辑没有核酸酶

尽管整合的机制还不清楚,但自1998年以来,研究人员一直在使用AAV载体对哺乳动物细胞进行基因编辑。那一年,罗素和他来自华盛顿大学的研究人员报告了一个令人惊讶的发现——当通过AAV感染传递时,同源臂相对较短(1 kb)的基因靶向载体进行同源重组,其频率比通过裸DNA转染传递的相同靶向载体高3个数量级。通过添加当靶向载体插入功能启动子(基因捕集器)的下游时,另外一直致力于开发高效基因靶向方法的研究方法改善了该发现。得到的基因靶向系统可用于在G418选择后常规将感兴趣的序列递送1-40%(Kohli等人2004Kim等人2008年)。虽然这种AAV效应背后的生物学仍不清楚,但是,AAV基因组由单链DNA组成,这是单链DNA的组成,其特别适用于链侵入,其具有同源重组途径的关键步骤。

Waldman实验室在乔治城大学医学院在过去的十五年里经常使用此基因编辑系统。他们的实验室的一些例子包括使用AAV将表位标签引入人体细胞中P53和PTEN肿瘤抑制基因的内源等位基因(Kim等人2008年)。他们还使用AAV基因编辑将自然发生的致癌突变引入人类细胞中STAG2肿瘤抑制因子的内源性等位基因(Kim等人,2016)。

Waldman实验室设计了他们的AAV标记矢量(pAAV-SEPT-AcceptorPaav-TK-Contentor)因此它们可以很容易地适应编辑您的选择基因。这些载体非常相似,均具有粒因链接器,用于添加特异性的基因1 kB同源臂侧翼浮动的新臂R.基因。Paav-SEPT-Acceptor,优选的载体,含有促进剂拼接受体 - IRES-NEOR.基因,通过基因捕获富集提高了同源整合的效率,而Paav-TK受体具有常规的异源启动子驱动TK-NeoR.基因。

为了修改这些标记向量的特定基因,该实验室建议使用感兴趣的修改设计同源臂,从诸如IDT或Genscript等基因合成公司订购它们,并将它们顺序地克隆到所选择的受体载体中。然后通过助助剂的293t细胞瞬时转染将载体包装成AAV病毒粒子,并用于感染受体细胞。在G418选择之后,通过PCR鉴定单个基因编辑的克隆。然后,如有必要的话,进行后续实验,浮动的NeoR.通过腺细胞感染除去基因。

与CRISPR编辑相比,基于aav的基因编辑

CRISPR当然,它开启了一场基因编辑革命。然而,尽管CRISPR可以通过异常的双链断裂修复引入非序列特异性的移码突变,但开发基于CRISPR的通过同源修复模板进行同源重组产生knockins的高效方法更具挑战性。正是这种应用——序列特异性敲除基因的创建——最适合AAV方法,因为它通常对g418选择的克隆产生1-40%的敲除效率。

然而,在决定是使用AAV或CRISP的基于AAV或CRISP的基于AAV的方法存在重要的缺点。首先,与CRISPR不同,基于AAV的方法仅能够一次靶向单个基因的等位基因。因此,需要同时修改基因所有等位基因的应用,或者需要在同一细胞中同时改变多种基因,更适合基于CRISPR的方法。其次,通常用于基因编辑的AAV准备低滴定度因此,并且能够仅感染给定实验中使用的细胞的一小部分。因此,基于AAV的方法需要G418选择受感染的克隆,这使其不适合在活的有机体内应用程序。第三,即使在最优化的组织培养系统中,基因编辑的效率也偶尔小于1%,几乎从未超过40%。虽然这是可比的或比基于最新的基于Crispr的方法的效率相当或更好,但它并不总是理想的。由于这些限制,AAV方法最适合于基于组织培养的方法,该方法仅需要改变基因的单个等位基因,例如引入杂合内源性表位标签,或将基因的显性突变引入内源性培养细胞的等位基因。

AAV基因组编辑与靶向核酸酶相结合

用靶向核酸酶编辑AAV基因组

为了结合AAV和基于CRISPR的方法的各个优势,最近有几个组通过使用靶向核酸酶引入双链断裂来提高基于AAV的基因编辑的效率。Asuri等人例如,使用锌手指将AAV介导的基因组在人体和IPSC中的效率提高〜0.2%至〜1.5%的效率。在最近的工作中,研究人员将AAV与CRISPR系统组合起来。Ohmori等人2017用对偶向量构成的系统SaCas9在一个AAV中的GRNA和第二个AAV中的修复模板,将其修复模板递送给小鼠的Zygotes,从而纠正导致血友病B的突变。

遗憾的是,将Crisprs与AAV进行改进的基因组编辑的工作相结合的是,即使是SACAS9和他们的必要GRNA这样的小CAS9同源物,即使是SACAS9和他们的必要GRNA)基本上所有的AAV的〜4.5 KB包装能力。幸运的是,研究人员已经设计了将Crispr组分作为核糖核蛋白(rnp),可与病毒载体分开供应。这种递送方法释放了AAV中的空间,允许研究人员用修复模板填充它。

Bok and Porteus 2017最近的研究表明,通过将CRISPR组件作为rps递送,并将分布在两种aav上的两半修复模板递送,可以用两种aav的内容对目标位点进行顺序修复。使用这种技术,Bok和Porteus提供了一个修复模板,如果在单个AAV中递送,该修复模板将占用约6.5 kB的时间。他们报告K562白血病细胞系的修复效率约为40%,t细胞和造血干细胞的修复效率分别为~8和9%。未来的研究人员可以将这项技术应用于需要大规模基因融合的应用,有效地提供大型修复模板。将AAV和基于crispr的方法结合在一起的目前最先进的技术在最近的几个综述中得到了描述(Howes和Schofield, 2015;Moser和Hirsch,2016年;Epstein和Schaffer, 2017

希望您能够在我们的一些其他博客文章中查看AAV的许多应用中的一些应用程序,并且还能够通过我们的病毒服务浏览一些准备好使用的AAV。除了作为基因递送的选择的向量外,现在您知道AAV可以提供强大的提升到基因组编辑实验。我们很高兴看到您如何继续使用和开发您自己的研究和鼓励您创建任何新的AAV工具的AAV。


非常感谢我们的客座博主,托德·沃尔德曼!

托德·沃尔德曼Todd Waldman是戈特敦医学院Lombardi综合癌症中心的肿瘤学教授。他的研究目前侧重于确定Cohyin基因失活在人体癌症中的机制和后果。

参考

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9.J Moser,Rachel和Matthew L Hirsch。“DSB介导的基因编辑技术的AAV verving化。”目前的基因治疗16.3(2016):207-219。PubMed.PMID: 27280971

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