腺嘌呤基础编辑器（ABE）调解A•T-to-G•C基础变化（图1），但是使这些基础变化可能具有挑战性，特别是在原发性人体细胞中。现在，科学家们梁疗法已经找到了改善初级人体细胞（Gaudelli等，2020）中编辑的方法。
一种广泛使用的基础编辑ab7.10系统(新一代ABEs的起点)由3个组件组成:
- 一个脱氨酶（Tada，最初来自E.coli，在ABE7.10中命名为TadA7.10)
- 催化受损的CA蛋白（DCA或CAS酸酐）
- 将TADA和DCA的复合物定位为感兴趣的基因组DNA的指导RNA
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| 图1所示。当ABEs起作用时，它们结合DNA，使TadA结构域可以编辑可获得的短单链DNA拉伸。从图片高德利等人，2020年。 |
定向演进识别adenine基础编辑器，并在细胞系中改进了编辑
妮可Gaudelli.他是Beam Therapeutics的副主任兼基因编辑技术负责人以前开发的细菌选择策略（Gaudelli等，2017）与TADA序列的合成文库相结合，以创造第八代腺嘌呤碱基编辑器，称为ABE8（Gaudelli等，2020）。生成的abe8s需要产生3个并发基础编辑以承受抗生素选择。因此，塔达的8个突变可以创造所有三种编辑，因此更有效。通过这些突变和先前描述的TADA突变（Gaudelli等，2017），它们被修改为ABE7.10，导致了名为“ABE8.x”的变体：“8”代表第八轮的ABE演变和“X“是占号的占位符，用于识别进化的TADA域中的突变。
因为ABE7.10包含野生型TadA和TadA7.10的异二聚体融合，他们设计了一套类似的ABE8的(ABE8.x-d)。为了评估从复合物中去除野生型TadA的效果，研究人员开发了第二组:
- ABE8。x-d版本携带野生型TadA和进化的TadA区域的融合。
- ABE8。x-m版本只包含进化的TadA，比ABE8.x-d小约500个碱基对。
这导致了总共40个新的ABE8变种。当比较这些版本在人类细胞系中的目标DNA编辑效率时，他们发现了更小的版本，ABE8。显示出与ABE8.x-d相似的编辑行为。总体而言，与ABE7.10相比，ABE8s显示编辑活动中位数增加了1.94倍。根据原空间中的位置，abe8的编辑能力范围从位置A5-A7高1.5倍到位置A3-A4和A8-A10高3.2倍。
研究人员选择了8个测试的ABE8构建(abe880 -m/d、ABE8.13-m/d、ABE8.17-m/d、ABE8.20-m/d)进行进一步评价。
由ABE7.10中被催化受损的D10A镍酶产生的意外插入和删除(indel)可能是一个问题。因此，作者使用催化“死亡”的方法创建了ABE8结构。链球菌CAS9（DC9-ABE8.X-M / D）。DC9-ABE8.X-M / D构建体在人体细胞系中展示了2.1倍的目标DNA编辑效率，同时与ABE7.10相比减少了90％以上的诱导频率。
选择Cas9蛋白质以增加腺嘌呤基础编辑器的靶向范围
最常用的链球菌Cas9需要基因组DNA中的目标位点包含一个由5 ' -NGG-3 '组成的特定原间隔子邻近基序(PAM)(“N”可以是任何核苷酸碱基，后面是2个鸟嘌呤)。这限制了ABEs作为不包含合适PAM的DNA位点的使用，不能有效编辑。为了扩大ABE8的目标范围，团队进行了替换链球菌Cas9在ABE复合体中与pam变异Cas9蛋白:S.。化脓性链球菌NG- cas9 (PAM: NG)来创建NG- abe8。xm / d和S.。金黄色葡萄球菌Cas9 (PAM: NNGRRT)创建Sa-ABE8.x-m/d。有了这些变异，ABE8可以瞄准基因组中的许多其他位置。与ABE7.10相比，NG-ABE8。xm/d显示中位数增加1.6倍，Sa-ABE8。x-m/d编辑频率中位数比ABE7.10增加2倍。在ABE8复合物中使用非标准Cas9的能力使碱基编辑的目标范围更广。
基础人体细胞中的基础编辑
细胞治疗方法可以使用碱基编辑器纠正干细胞中的突变，并将纠正后的细胞返回给患者。例如，引起镰状细胞病和地中海贫血的血红蛋白(-珠蛋白)缺陷可以通过胎儿血红蛋白的表达而减轻。先前的研究表明，即使在成人患者中，伽马血红蛋白(HGB1/2)启动子区一个碱基的改变也会导致胎儿血红蛋白的持续表达。为了分析ABE8在初级人类细胞编辑中的临床应用，研究人员检测了ABE8在CD34+造血干细胞中的作用。ABE8有效地编辑了胎儿血红蛋白启动子，使胎儿血红蛋白的持续表达高于ABE7.10。
除了干细胞，作者还使用8个选定的ABE8s和ABE7.10靶向了原代人T细胞中的6个基因。他们通过测量这六个基因蛋白表达的减少来量化基因组编辑。所有ab8s的编辑效率均高于ab7.10，其中ab8.20 -m在原代人T细胞中降低蛋白表达最多。
在编辑单一基因非常有用时，有时，您需要修饰多种基因以产生细胞表型。再次abe8.20-m是赢家。它可以同时编辑3个基因（98.1％，98.3％，或98.6％的效率），并且优于ABE7.10至少1.4倍。ABE8.20-M进行编辑初级人T细胞的能力有效地使其成为T细胞疗法发展的有希望的工具。
减少ABE8S中的离心编辑
虽然基础编辑器是精确的分子工具，但它们确实具有不希望的脱靶编辑效果。已经描述了eBES引入脑育DNA和RNA依赖性的基础变化或独立于所用的GRNA（Gaudelli等，2017）。作者测试了ABE8.17-M，发现一个基础变化突变（ABE8.17-M + V106W）（Gaudelli等，2020）能够减少离药RNA和GRNA依赖性DNA编辑，同时保持 -目标基本编辑功能。
碱基编辑器的传递方法对偏离目标的编辑效果起着作用。ABEs可以以质粒或mRNA的结构形式引入细胞。在原代人类细胞中，ABEs mRNA的传递导致更有效的靶上编辑和减少脱靶编辑频率。对于需要高DNA编辑特异性的应用，例如潜在的治疗方法，作者推荐信使rna传递，ABE8的V106W版本，以及经过深思熟虑的指南nas。特别值得注意的是，这项工作中报道的ab8s没有引起全基因组、引导独立的脱靶脱氨，这是治疗应用的一个重要属性。
ABE8S展示了整体改进的基本编辑能力，即使在难以瞄准的网站上也是如此。特别是，它们在人体细胞系和主电池中更强大地编辑的能力使它们成为基础编辑工具箱的一个很好的补充。
参考文献
Gaudelli NM，Komor Ac，Rees Ha，Packer Ms，Badran Ah，Bryson di，Liu Dri（2017）在没有DNA裂解的基因组DNA中的A•T至G•C的可编程基础编辑。自然551：464-471。https://doi.org/10.1038/nature24644
Gaudelli NM, Lam DK, Rees HA, Solá-Esteves NM, Barrera LA, Born DA, Edwards A, Gehrke JM, Lee S-J, Liquori AJ, Murray R, Packer MS, Rinaldi C, Slaymaker IM, Yen J, Young LE, Ciaramella G (2020) Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology.https://doi.org/10.1038/s41587-020-0491-6
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