CRISPR/Cas9的腺病毒传递旨在将基因组编辑扩展到原代细胞

由肯德尔摩根

Adenoviral-CRISPR-Cas9-delivery-plasmids-Manuel-Goncalves 最初发布于2014年9月30日,最后更新于2020年12月10日,由Benoit Giquel撰写。
腺病毒载体vwin668(AdVs)已应用多年在活的有机体内传递和基因治疗是研究最多的病毒之一。腺病毒是一种非包膜双链DNA病毒,基因组大小约36kb,不整合到宿主基因组中,消除了其他载体的致癌性或遗传毒性风险(Lukashev et al., 2016)。包裹基因组的蛋白质衣壳主要由三种易于修饰的蛋白质组成,以便于其进入靶细胞(Beatty et al., 2012)。这些特点使AdV成为先进基因组编辑机制(如CRISPR-Cas)体内导入的有吸引力的候选材料。

下载Addgene的CRISPR 101电子书!

使用腺病毒载体递送gRNA和Cas9vwin668

与其他病毒载体相比,ad可以提供较大的转基vwin668因包装能力。例如,包装容量约为6kb的1一代ad载体的包装容量已经超过了AAV载体。这个容量大到足以在单个病毒颗粒中携带Cas9基因和gRNA表达盒。AdV for的最早应用探索在活的有机体内CRISPR-Cas递送利用了非同源端连接(NHEJ) DNA修复机制,通过插入、删除或移码敲除基因(Ding et al., 2014, Wang et al., 2015)。在这些研究中,采用的策略是将标准AdV载体与Cas9和旨在靶向突变基因的gRNA一起递送到目标器官或组织。在一个科学报告Manuel Goncalves实验室在2014年的一篇介绍传递方法的论文中报道,ad介导的gRNA:Cas9核糖核蛋白复合物转导到转化细胞和非转化细胞产生的靶向诱变率与编码TALENs的同基因ad针对同一染色体区域实现的目标诱变率相似。CRISPR/ cas9衍生的rna引导的核酸酶在各种细胞类型中诱导的基因破坏频率在18%到65%之间(Maggio et al., 2014)。

NHEJ的另一种方法是利用同源性定向修复(HDR)敲入纠正基因。为此,你需要提供一个DNA模板来通过同源定向修复修复双链断裂,你可能需要使用两个病毒载体系统:一个载体用于Cas9/sgRNA,一个载体用于你的特定DNA模板。vwin668Manuel Gonçalves实验室在发表的第二篇论文中发现,利用这两个向量系统自然方法同年,将rna引导的核酸酶或TALENs与AdV供体DNA一起提供,导致绝大多数AdV修饰的人类细胞接受无疤痕同源定向基因组编辑(Maggio et al., 2014)。Gonçalves表示,他们将这种现象归因于覆盖线性双链AdV基因组末端的末端蛋白质的存在。这种蛋白质-DNA结构可能会减少供体DNA与散发的双链染色体DNA断裂相互作用的可能性,而这种断裂“总是自然发生的”。

这些腺病毒CRISPR/Cas9基因组编辑由Manuel Gonçalves和他的同事在莱顿大学医学中心开发和演示的工具现在可以在Addgene连同他们的描述试验协议。已沉积到Addgene的三个质粒是:pAdSh.PGK.Cas9,pAdSh.U6.gRNAS1,pAdSh.U6.gRNAGFP

Gonçalves说,AdVs的优势包括他们的episomal性质和非常有效的引入DNA到治疗相关的,非转化的哺乳动物细胞。这些病毒载体系统在分裂和静止、有丝分裂后的哺乳动物细胞中同样有效。

用腺病毒载体传递CRISPR的应用vwin668

从那时起,其他研究小组已经成功开发并使用AdV载体在几个生物系统中编辑基因。例如,它被用于遗传疾病,如b -地中海贫血、镰状细胞病、杜氏肌营养不良、α -抗胰蛋白酶缺乏症(迄今最广泛使用)或癌症基因治疗,如非酒精性脂肪性肝炎。由于经常使用Adv载体递送血浆蛋白的缺陷,基于HDR的CRISPR方法具有潜在的普遍治疗优势(Stephens等,2019)。如果能够实现足够的基因转移和敲入,“生产细胞”就能生产出纠正任何此类疾病的蛋白质。因此,该技术为相关grna和供体DNA的简单转换提供了一个潜在的平台

腺病毒CRISPR/Cas9基因组编辑工具还可以用于在成年动物的体细胞中传递Cas9和DNA模板,以创建特定癌症的动物模型。这正是纪念斯隆凯特琳癌症中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)安德里亚·文图拉(Andrea Ventura)的实验室为创建eml4 - alk驱动的肺癌模型所做的工作(madalo等人,2014)。这些工具可以在Addgene网站上找到,并且可能对希望创建这种动物模型的实验室有用。

在你的CRISPR/Cas9研究中vwin668开始使用腺病毒载体!

使用Gonçalves和Ventura实验室的质粒获取关于CRISPRS/Cas9的腺病毒传递的更多信息,包括协议,请访问Addgene的质粒:pAdSh.PGK.Cas9(PGK启动子表达S. pyogenes Cas9)和U6启动子驱动的引导RNA构建,pAdSh.U6.gRNAS1pAdSh.U6.gRNAGFP,也腺病毒Cas9腺病毒EA。或者如果你正在寻找更广泛的CRISPR质粒工具,可以在Addgene's上找到更多的质粒、CRISPR技术指南、常见问题和CRISPR资源CRISPR页面


参考文献

腺病毒的组织特异性靶向研究。见于:病毒在癌症治疗中的应用。爱思唯尔,页39 - 67

Ding Q, Strong A, Patel KM, Ng S-L, Gosis BS, Regan SN, Cowan CA, Rader DJ, Musunuru K(2014)用体内CRISPR-Cas9基因组编辑永久改变PCSK9。Circ Res 115:488-492。https://doi.org/10.1161/circresaha.115.304351

Holkers M, Maggio I, Henriques SFD, Janssen JM, Cathomen T, Gonçalves MAFV(2014)腺病毒载体DNA与工程核酸酶精确的基因组编辑。Nat方法11:1051-1057。https://doi.org/10.1038/nmeth.3075

Lukashev AN, Zamyatnin AA Jr(2016)病毒vwin668载体用于基因治疗:现状和临床前景。生化莫斯科81:700-708。https://doi.org/10.1134/s0006297916070063

madalo D, Manchado E, Concepcion CP, Bonetti C, Vidigal JA, Han Y-C, Ogrodowski P, Crippa A, Rekhtman N, de Stanchina E, Lowe SW, Ventura A(2014)使用CRISPR/Cas9系统进行致癌染色体重排的体内工程。自然516:423 - 427。https://doi.org/10.1038/nature13902

Maggio I, Holkers M, Liu J, Janssen JM, Chen X, Gonçalves MAFV(2014)腺病毒载体转染rna引导的CRISPR/Cas9核酸酶复合物诱导多种人类细胞靶向突变。科学代表4:。https://doi.org/10.1038/srep05105

Stephens CJ, Lauron EJ, Kashentseva E, Lu ZH, Yokoyama WM, Curiel DT(2019)使用腺病毒介导的CRISPR/Cas9长期纠正血友病B。控制释放学报298:128-141。https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2019.02.009

王丹,Mou H,李胜,李勇,Hough S, Tran K,李军,Yin H, Anderson DG, Sontheimer EJ, wenz,高刚,薛伟(2015)腺病毒介导的Cas9特异性免疫应答小鼠肝脏Pten体细胞基因组编辑。人类基因治疗26:42 - 442。https://doi.org/10.1089/hum.2015.087

Addgene博客上的其他资源vwin.com mobile


寻找CRISPR质粒?点击这里在Addgene找到他们

主题:CRISPR,m.vwin01.com ,运载体vwin668

留下你的评论

分享科学变得更容易了……订阅我们的博客

订阅