用“elegans”方法提高CRISPR/Cas9编辑效率

客人的博客

最初发布2015年1月27日,最后更新了12月17日,2020年。

这个帖子是贡献的Jordan Ward是加利福尼亚大学圣克鲁斯大学助理教授。

利用CRISPR技术在秀丽隐杆线虫中插入选择性标记。新兴CRISPR / Cas9编辑技术改变了各种各样的生物和细胞系的实验调色板。在C. Elegans.,我用来在发育过程中研究基因调节的模型生物之一,CRISPR / CAS9允许我们删除序列并引入突变和表位,以前所未有的便利。这些新的C. Elegans.迅速富集的方法,不需要任何选择性标记留在编辑的动物中。

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开发CRISPR / CAS9编辑策略C. Elegans.

在寓言中表现出色和不可思议遗传学家与生物化学师在美国,我们遗传学家是一群懒惰的人,他们喜欢依赖于基因选择的可怕力量。敲入事件往往很少,任何实验的挑战都是如何有效地恢复这些编辑。最初的工作C. Elegans.依赖于耐药性的选择性标记(等等。,2013)、荧光(绿色荧光蛋白;Tzur等等。,2013),或拯救突变表型(unc - 119)(狄金森等等。,2013)。这些方法允许有效地恢复敲扣,但确实导致介绍1-2千千千碱类的额外序列。CRE介导的切除选择性盒子中最小化添加的序列,留下34bp“疤痕”,但目前需要额外的实验操作。在某些情况下,需要注射CRE,然而自我切除盒的发展(Dickinson等等。,2015年)使这一步像热休克一样简单,以诱导基因敲入中包含的Cre重组酶的表达。包括cre介导的标记的切除,大约需要3-4周的时间来获得一个纯合子,异交敲入准备用于实验。

2014年,发表了几种手稿遗传学详细方法,其中选择了在其他基因组基因座的敲除和敲除,在其他基因组的敲除和敲击中加入的编辑事件的选择。第一种方法 - 共同克里克普尔克雷格·梅洛的实验室- 使用的灭活unc-22基因作为他们的选择标记(等等。,2014)。与此同时安迪火的实验室使用寡核介导的敲入优势突变,称为共转化(Arribere。,2014年)。在这两种情况下,必须去除所选择的突变,这可以通过将动物分离具有特定的可见表型来完成。在报告之后,这些方法可能会更加强大,其中一个人可以使用线性修复模板(即PCR衍生的DSDNA),其中包含30-60个基座同源臂敲入大型表位(如GFP)(和平et al。,2014年)。2017年报告了这种方法的进一步发展,使用直接注射CRISPR / CAS9核糖核蛋白复合物与线性DNA作为修复模板减少生成编辑只有四天的时间(paaix等人,2017)。共crispr和共转换方法的优势在于可用于任何遗传背景,但需要不同数量的实验操作和筛选。

C. elegans中的Crispr编辑的共同选择策略提高了效率

在我最初的直接筛选工作中,我很幸运——或者说很不幸——与低效的sgRNAs一起工作,这与paaix详细介绍的方法相似et al。虽然我能够将2xFlag表位敲入我感兴趣的基因,但我遇到了低效率(0.13%)和费力的处理(筛查768 F1动物)。在未经编辑的动物海洋中恢复稀有编辑事件让我作为“大海捞针中的针”类型的问题,并导致我探索交替的方法。作为一个“懒惰”遗传学家,我开发了一种依赖于修复条件 - 致命突变的共选方法,以确定具有最小筛选工作的编辑。选择致命突变的修复应消除大部分未经编辑的“干酪”,促进了编辑动物的恢复。

在秀丽隐杆线虫中使用CRISPR敲入FLAG标签。

在2015年(病房里,2015),我证明了修复温度敏感的选择pha-1突变显着富集2x和3xFlag表位进入其他非连接的基因座;pha-1 (e2123)突变蠕虫在15ºC下完全可行,但在25ºC下表现出完全胚胎致死性。该方法导致效率从11-100%的F1动物携带精确的敲击,并且可以在八天内获得纯合的敲击性动物。除了父母动物之外的唯一的动物,刚刚拯救了后代,这使得筛选极快。这种严格的选择允许我优化一系列编辑参数:具有35-80bp的同源性臂的Oligo修复模板,并且DNA双链从所需的插入部位断裂到54bp,结果有效编辑。修复寡核苷酸不需要净化页面,虽然这样做会提高敲击效率。最后,如图所示果蝇S2细胞(Böttcher.等等。,2014),非同源终连接的失活导致敲击效率的进一步增加,推测通过将DNA突破到同源重组修复途径中。需要执行的试剂pha-1共同转换可以通过Addgene。2019年,Farboudet al。描述了另一个类似的共转换标记(修复azen-4 (cle10ts)等位基因),增加实验选择。

扩展和改进CRISPR / CAS编辑工具箱Celegans.

最近的工作进一步提高了CRISPR的基因组编辑的效率,无论是改进的GRNA还是修复模板设计,交付,筛选等。以下是过去几年的一些亮点:

修复模板设计

迈耶实验室精心描述了编辑的几个方面。首先,他们设计了单链修复模板设计指南(Farboud等,2019)。

MELLO实验室还报告说,修改寡核苷酸的5'修改用于通过PCR产生线性DSDNA修复模板的寡核苷酸提高了效率(Ghanta等人,2018)。他们在这项工作的基础上进一步发现熔化并迅速冷却dsDNA修复模板显着提高了编辑效率(Ghanta等,2020)。他们还发现大多数敲门敲入后24小时后发生,使敲击更有效。纯PCR修复模板对于有效的敲击至关重要(Ghanta等,2020)。这些来自Mello实验室的这些改进导致了显着高的编辑效率,从单个注射的动物获得多达100个独立的GFP敲击。

PAM序列的考虑

对PAM进行5 '的修改,与PAM相同链对应的序列编辑效率更高,而对相反链对应的PAM序列编辑3 '的效果更好(Farboud et al., 2019)。

Meyer Lab还确定了使用两个Cas9目标进行编辑的最佳PAM方向。在DSB形成之后,PAM的5'末端朝向的5'端末端的定向,确保染色体保持在染色体上,最有效(Farboud等,2019)。使用这种方法,它们能够沿1.5 kB的道次插入10kB的非同源序列或一系列单核苷酸取代,所有无选择标记。

Crispr in.Celegans.

Meyer和Mello实验室还确定了几个实验装置,可以提高CRISPR的效率Celegans.Meyer Lab还发现交配改进的编辑效率,表明精子对Cas9编辑更加宽容(Farboud等,2019)。Mello Lab的工作大大改进了使用线性修复模板的RNP编辑。他们发现Cas9 RNPS可以在高浓度下有毒,并通过使用更稀释的混合物来改善效率(Doksin等,2018)。MELLO实验室还报告了使用主要丢失在F2动物中的共注注记器的高效编辑,除去了远离共转化标记的需要。

扩大到Cas9之外

自CRISPR / CAS9编辑方法的发展以来,其他CAS蛋白已适用于Celegans.。2017年,科斯瓦根实验室发展CAS12A(CPF1)进行编辑Celegans.(Ebbing等人,2017)。因为C. Elegans.有一个富有的基因组,很难找到适当的NGG PAM网站到目标。(t)TTN PAM主题所要求的acidaminococcus sp.。BV3L6 Cas12a (AsCpf1)缓解了这个限制,允许从更多的站点编辑Celegans.基因组。

用于编辑的工具包Celegans.

开发工具包等saptrap crispr / cas toolkitSapTrap-SEC包Celegans.基因组工程也促进了CRISPR编辑Celegans.。这些模块化工具包构建了编码GRNA转录物的单个质粒靶向载体和您选择的修复模板。Saptrap Builder等工具大大简化了这些构造的设计,允许新手研究人员快速轻松地开始基因组编辑(Schwartz等,2018)。

看到更多的CRISPR工具Celegans.,访问Addgene'sC. Elegans.Crispr质粒页面。

未来的观点

有趣的是,收件人2015年突破奖包括Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier,因为他们开创性的CRISPR/Cas9工作(现在被2020年诺贝尔化学奖认可),以及Victor Ambros和Gary Ruvkun,因为他们在微rna方面的开创性工作C. Elegans.。的C. Elegans.在无数其他系统上通知小RNA的工作,而且将CRISPR技术导入C. Elegans.是我们社区的革命性创新。利用修饰Cas9蛋白调节基因表达的哺乳动物和酵母细胞的研究进展(CRISPRi/CRISPRa),可视化特定的基因组位点(CRISPR-imaging),或寻找与给定基因组位点相关的蛋白质(CRISPR-ChAP-MS)可以进一步改变人类可以想象的实验范围C. Elegans.。同样,本文中概述的一些“elegans”方法——特别是共选择方法的使用——可以极大地简化其他生物体和系统的编辑,从而在更广泛的领域中取得快速进展。


感谢我们的嘉宾博主!

约旦Ward-minJordan Ward是加州大学圣克鲁斯大学助理教授,他的团队专注于线虫蜕皮和精子发生的基因调控。他的小组还建立了改善基因组编辑和有条件地操纵蛋白质的工具。了解更多信息网页或者跟随他推特

参考文献

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