CRISPR 101:抗CRISPR蛋白关闭CRISPR- cas系统

由Beth Kenkel.

Beth Kenkel.

最初发布于2017年5月23日,最后由Jennifer Tsang于2020年7月23日更新。德赢在线

antirispr就像一个开关CRISPR-Cas技术在不断发展。Cas蛋白的变体可用于基因组编辑,激活基因表达,压制基因表达, 和。但是有一件事失踪了:一种关闭CAS活动的方法。关注的是,较长的CAS在细胞中保持活跃,有用于外目标编辑的机会更大。虽然方法可以使用CAS活动的方法或者毒品的发展,该领域缺乏Cas蛋白的“开关”。

发现抗crispr蛋白

那是,直到发现抗crispr蛋白2012年(Bondy-Denomy et al., 2012)。抗crispr (Acr)蛋白是噬菌体衍生的CRISPR-Cas系统的小蛋白抑制剂,帮助噬菌体逃避细菌的CRISPR-Cas免疫系统。这些Acr蛋白质最初是在I型CRISPR-CAS系统

四年后Sontheimer戴维森实验室发现三抗crisprs用于II型系统脑膜炎奈瑟氏菌(NME)(Pawluk等,2016)。虽然链球菌Pyogeneses Cas9(SPYCAS9)是最常用的,并且学习良好的CRISPR系统,脑膜炎奈瑟菌也可用于基因组编辑。在这项研究中,实验室发现抗crispr抑制Cas9活性在HEK293中减少编辑从控制样本的~30%到Acr样本的0-10%。Acr蛋白也可以用来防止dCas9与DNA的结合。

自这些早期的防克里普尔研究,科学家有发现了超过50个抗克隆蛋白与CRISPR-CAS系统相互作用,例如cas3、Cas9、Cas12、Cas13级联(Marino等人,2020年)。一些Acr蛋白针对特定的Cas蛋白,而另一些可以抑制来自多种细菌的CRISPR酶。

关于防克里克尔命名的一项说明

Acr家族蛋白质以它们阻止的CRISPR-CAS系统类型,并按发现顺序编号(Bondy-Denomy等,2018)。例如,上面提到的AcrIIA4表明它是发现的第四个阻断II-A型CRISPR-Cas系统的Acr蛋白。完整的Acr蛋白列表,按照它们所阻断的CRISPR-Cas系统的类型排列可以在这里找到

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抗克里克人蛋白如何工作?

抗CRISPRS蛋白质是高度多样化的,但大多数块CRISPR活动三种方式中的一种:

  1. 抑制DNA结合
    1. 示例:Acria4.阻塞Cas9与PAM站点的交互(Dong et al., 2017),和acri3导致Cas蛋白Diferize阻止PAM识别站点(哈林顿等,2017)。
  2. 抑制CRRNA装载
    1. 示例:Acriic2与Cas9的交互干扰和阻止crRNA-Cas复合体的正确组装(Zhu等,2019)。
  3. 抑制DNA裂解
    1. 举例:Acriic1与Cas9的HNH内切核酸酶染色并防止靶DNA裂解(Harrington等,2017)。
显示CAS蛋白和GRNA形成复合物,结合DNA和切割DNA的示意图。在每个步骤中是抗克切者蛋白的例子,可以抑制每个步骤
图1:抗CRISPR蛋白(Acr’s)可以通过多种方式阻断CRISPR活性,如抑制crRNA装载、抑制DNA结合或抑制DNA裂解。

在你的实验中使用抗crispr蛋白

减少非目标效应

延长的CAS活动可以增加偏离目标编辑的机会,特别是在大部分目标编辑后发生了偏离目标编辑。防克隆蛋白可用于限制这种非目标编辑,但何时是关闭CAS活动的最佳时间?使用抑制剂时序实验Doudna实验室发现,至少50%的目标CAS9编辑在前六个小时内发生。在引入Cas9 RNPS后六小时添加到人体细胞时,Acria4减少了脱靶编辑,同时仍然允许对目标编辑(Shin等,2017)。

Acrs也可以用来减少偏离目标的编辑基本编辑,将一个核苷酸碱基对转化为另一个碱基对。

CRISPR活动的时间,空间或有条件控制

通过诱导型启动子,光或小分子调节ACR蛋白可以实现CRISPR-CAS活动的快速,动态和空间控制。例如,融合AcrA4II到光敏LOV2域允许反crispr活动由蓝光控制(Bubeck等人,2018)。

减少组织中CRISPR-Cas编辑的细胞毒性

Acr蛋白的小尺寸(约50-200个氨基酸)意味着它们可以被递送在活的有机体内使用AAV载体。有办法关闭CRISPR-Cas系统防止偏移效应和细胞毒性这是组织中过度核酸酶活性的结果(Li et al., 2018)。

在工程病毒时选择标记

ACR基因可作为工程病毒中的阳性选择标记用作阳性选择标记。例如,使用ACR基因替代难以工程的岛状沙锥状病毒2的基因(Mayo-muñoz等,2018年)。只有基因缺失的病毒颗粒可以在攻击时恢复美国islandicusCRISPR-Cas系统。

噬菌体疗法

噬菌体疗法使用噬菌体治疗细菌感染,作为抗生素的替代品。但由于许多细菌病原体拥有CRISPR-Cas系统,噬菌体治疗可能没有那么有效。这就是Acr蛋白质发挥作用的地方。Acr蛋白足够小,可以被设计成“保护”治疗性噬菌体,以保护它们免受致病菌的CRISPR-Cas系统的伤害。

结论

Crispr是制作那些基因组编辑的好方法。但是,同样重要的是翻转交换机并关闭CRISPR活动的方法。关闭CRISPR活动的能力是朝着基于CRISPR的疗法和更精确的编辑在实验室中的重要一步。


参考

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