抗体101:抗体入门

由Aliyah Weinstein.

您可能已经听过该术语抗体在新闻中或实验室中扔掉。但迄今是抗体的,免疫系统的组成部分是如何有用的?让我们找出来!

什么是抗体?

抗体,也称为免疫球蛋白,是〜150kDa,Y形蛋白,其是免疫系统的天然部分和可用于各种研究应用的工具。在免疫系统内,抗体由B细胞产生。它们与细胞外病原体表面的蛋白质结合,例如寄生虫或微生物,或者在已经用微生物感染的细胞表面表达的蛋白质,以触发清除这些感染的免疫级联。在免疫系统中产生抗体反应的任何东西被称为抗原。

抗体结合蛋白质的能力对于研究应用也很有用,因为它们使科学家能够瞄准他们感兴趣的特定蛋白质。一旦一种蛋白质被抗体瞄准,你就可以通过荧光或化学发光来观察该蛋白质,将蛋白质沉淀出溶液,或分离表达该蛋白质的细胞。继续阅读,了解更多关于抗体的知识,以及如何在实验室中使用它们!

抗体的一部分

抗体具有两个区域:Fab,或抗原结合区域,和Fc或可结晶区域。两种免疫球蛋白(Ig)重链和两个IG轻链构成每种抗体分子。Fc区和Fab区的一部分由IG重链制成,并且使用IG轻链完成了Fab区域的其余部分。重链和轻链的可变区决定了抗体识别和结合的抗原。

抗体原理图。两条重链形成Y形,而两个较短的灯链旁边是Y形的每个分支。抗原结合位点包括y形状顶部的光和重链。抗体的顶部是Fab结构域,抗体的底部是Fc结构域。
图1:抗体包含Fc, Fab,重链,轻链,恒定区,可变区标记图

重链的恒定区域决定了抗体的同种型 - 即五个宽的抗体组中的一种(IgM,IgD,IgA,IgG或IgE)。在免疫系统的背景下,每种同种型在免疫应答的不同时间表达,并引发不同的免疫级联。在研究环境中,不同同种型的抗体可以在相同的实验中一起使用,因为用于检测抗体存在的试剂部分在其同种型上取决于其同种型。

抗体的可变区不能识别目标蛋白的全部:相反,它能识别蛋白质的一小部分,称为表位。表位长度在5-8氨基酸之间,典型的5或6个氨基酸(Cruse等,2004)。因为蛋白质比这大得多,所以它可能含有许多抗体可以识别的表位。想象一下你正在做一个单词搜索拼图。你并不总是要发现整个蝙蝠的整体,但你可能会看到一些字母,能够猜测那个字母是否是你正在搜索的词的一部分。抗体可以识别氨基酸的线性化序列,或仅在其3D构象中。

抗体和生产的类型

在免疫系统中,抗体由B细胞产生。但是,实际上有很多方法可以产生抗体用于研究目的,其中一些利用了自然免疫系统的产生和更多的工程方法。每种抗体和生产策略都有各自的优缺点。

多克隆抗体

这些抗体来自动物,如兔子或山羊;给动物注射你想让抗体识别的抗原。这引发了动物体内的免疫反应,它的B细胞会大量产生针对注射的蛋白质的抗体。几周后,从动物身上抽取血液并提取抗体。这些抗体可以识别目标蛋白上的各种表位,因此被称为多克隆。多克隆抗体能够识别目标蛋白上的多个表位,因此具有更强的识别能力。然而,每种动物都会产生针对不同蛋白质表位的抗体,所以很多蛋白质表位之间的变异是一个大问题。

单克隆抗体

另一方面,单克隆抗体是所有识别目标蛋白的相同表位的均相抗体群。最常见的是这些抗体由杂交瘤产生。杂交瘤通过融合B细胞形成,所述B细胞已从注入蛋白质抗原的动物中提取到骨髓瘤细胞。然后通过限制稀释余亚克隆的杂交瘤,其产生产生单个抗体变体的细胞的永生化的克隆群。由于识别目标蛋白的单个表位,单克隆抗体不太可能与其他类似的蛋白质交叉反应。然而,杂交瘤的DNA中的小突变可以发生,称为遗传漂移,这意味着随着时间的推移,您希望它产生的抗体不一定是您所在的。

重组抗体

类似于单克隆抗体,重组抗体是一个均匀的人口。然而,与来自天然存在的免疫球蛋白基因的单克隆抗体不同,重组抗体是基于质粒的。它们的序列可以针对特异性和敏感性进行优化,例如通过改变某些氨基酸以改善其稳定性。此外,这是向量的选择可以影响抗体的表达水平(Ayyar等,2017)。

从NeuroMab / Trimmer Lab中查看重组mAb。

单链可变片段(SCFV)

Y型igG和单链抗体的对比图。scFV要小得多,只由轻链和重链的可变区域组成。
图2:IgG抗体与单链抗体的比较。

因为整个抗体分子并不需要抗原结合,所以可变区域可以单独结合产生为融合蛋白.SCFV由融合在一起的重和轻链的可变区组成,以形成可以识别靶蛋白的单一蛋白质(Wang等,2013)。这些蛋白质也是质粒衍生的。但是,A.缺点ScFv与整个抗体相比,它们对其靶蛋白的亲和力较低(Crivianu-Gaita 2016)。在本文中获取有关SCFV的更多详细信息:抗体101:单链片段变量(SCFV)

纳米级

HCAB由Y形重链Camelid抗体组成。相比之下,纳米仅包括可变片段,在Y形顶部的件。
图3:HCAB和纳米谱的比较。

纳米级是可变的重链片段重链骆驼抗体(Hcab) (Arbabi-Ghahroudi等人,2017)。虽然它们是基于美洲驼的免疫系统,合成纳米型或者可以从质粒中产生,节省时间和金钱。纳米级和甘露话与其靶抗原的特异性与规范抗体一​​样。它们还具有显着较小的优点,这意味着它们可以识别出完全抗体不会物理能够达到的表位。虽然全抗体是〜150kDa,但纳米曲面为12-15kDa。

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抗体的研究应用

您可以在各种领域中使用实验的抗体,包括神经科学免疫学.它们可用于在细胞裂解物,全细胞或组织样品中的蛋白质表达的定性和定量测量。许多使用抗体的实验使用识别您感兴趣的蛋白质的一抗,以及识别初生抗体并提供检测方法。您还想使用适当的控制来进行实验,以考虑抗体的潜在非特异性结合。让我们潜入并看看一些这些应用程序。

免疫印迹

用于检测含有蛋白质混合物的样品中蛋白质的存在。基于SDS-PAGE基于分子量分离蛋白质,随后转移到膜上。加入识别目的蛋白质的初级抗体,并将其与膜上的蛋白质结合。然后,添加二次抗体允许通过化学发光或荧光来检测蛋白质。Western印迹经常用于比较细胞类型或治疗条件之间的蛋白质表达的相对水平。如果您还可以使用适当的对照加载凝胶,可以定量使用它们,以使蛋白质浓度正常化。要获得更多详细信息,请查看我们的文章西方印迹的基础知识

一种蛋白质印迹显示GFP和Actin控制的频带。
图4:Western blot显示转染GFP质粒的细胞中GFP的表达。肌动蛋白(Actin)是一种常见的Western blots内对照物,显示在每个孔中添加了类似浓度的细胞裂解液。从图片Sun等人,2010

酶联免疫吸附试验(ELISA)

类似地,ELISA用于检测来自非均相混合物的单个蛋白质的存在 - 例如,来自培养细胞的细胞裂解物或培养基。ELISA可用于定量测量存在的蛋白质。该反应发生在96孔板中,其中使用初级和二抗捕获感兴趣的蛋白质并检测其存在。然后,测量可以通过每个阱的光量 - 所知和实验孔的光密度(OD) - 是已知的和实验孔的光密度(OD)。

要查找样品中的确切量的蛋白质,您将将样品与标准曲线进行比较。使用已知量的蛋白质的连续稀释,该曲线也以相同的方式检测。从OD和浓度创建的已知样品产生的标准曲线用于计算实验样品中蛋白质的浓度。

免疫沉淀

有时,而不是仅仅检测样品中的蛋白质的存在,而是希望从混​​合物中提取您的感兴趣的蛋白质。抗体也可以这样做!在该方法中,与微观珠结合的抗体抓住感兴趣的蛋白质并将其从溶液中拉出。一旦未结合蛋白质被洗掉,使用低pH缓冲液将感兴趣的蛋白质与珠子和抗体分离。然后,纯化的蛋白质可以用于实验中,以比较一系列样品中存在的蛋白质的相对量,例如Western印迹或ELISA,或用于研究蛋白质 - 蛋白质相互作用的其他实验。

流式细胞仪

流式细胞术用于检测整个细胞表面或内部的蛋白质。抗体 - 通常,与荧光团缀合的一抗,以避免在该实验中使用二抗 - 用细胞的混合物孵育。使用荧光标记的抗体检测蛋白质的技术称为染色。该抗体面板用于鉴定混合物中的感兴趣的细胞亚群,并测量这些细胞中或在这些细胞中或在这些细胞中的蛋白质的相对量:抗体可以与细胞表面上的蛋白质结合或细胞膜可以允许允许抗体与细胞内蛋白结合。

荧光信号通过流式细胞仪检测,并作为蛋白表达的代理。因为信号来自于抗体-荧光团偶联物,而不是由细胞本身表达,所以你可以在每个面板上研究蛋白质,这有很大的灵活性。流式细胞术的一个优点是能够使用多个荧光信号(多达12个或更多!)来同时测量同一细胞上多个蛋白质表达的相对或绝对量,并在样品之间进行比较。

细胞和组织标记

抗体可用于可视化组织(免疫组织化学)或细胞(免疫细胞化学)。这可以是安装到滑动件或整个器官的细胞或组织切片。由于保留了组织架构,因此该技术允许您不仅可视化特定蛋白质的存在,而且还可以在细胞或组织内的本地化。类似于流式细胞术,您将使用抗体染色一种或多种特定细胞类型的标记,以及您的蛋白质,以便最佳上下文化其本地化。这些可以使用荧光团缀合的抗体(即免疫荧光)或通过通过酶反应促进的比色反应来进行可视化。

免疫荧光染色CD31(绿色)、CARD14(红色)和pNFkB(蓝色)重叠在图像左侧。每个单独的频道都显示在右边的面板上。
图5:来自牛皮癣患者的损伤皮肤中CD31(绿色),卡14(红色)和PNFKB(蓝色)的免疫荧光染色,显示出炎症表型。使用未缀合的一抗检测每种蛋白质,然后使用荧光团缀合的二抗或Fab可视化。从图片哈登等人,2014

体内用途

对于研究和治疗目的,抗体可用于影响细胞过程在活的有机体内,这些被称为功能级抗体。一些研究和治疗用途重叠:抗体可以结合并抑制蛋白质的功能,以阻止其在体内的作用,或者它们可以通过与细胞表面受体结合来激活细胞途径。这些应用通常用于研究信号传导途径或发展治疗剂。

通过实验,可以将与荧光标签或其他标记缀合的抗体注入动物,以直接标记循环细胞或可从血液进入的其他细胞。然后,通过血迹或器官收获,可以使用诸如流式细胞术的技术进行标记的细胞。

结论

哇!现在你知道抗体可以用于很多目的!我希望你能欣赏那里的抗体是多少,以及它们可以使用多少种不同的研究应用。Addgene的抗体质粒集合包括表达抗体,纳米粒细胞和SCFV的质粒,以及用于开发和生产基于质粒的抗体的工具 - 我们总是在我们的收藏中养成!

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引用:

Camelid单域抗体:历史和未来展望。免疫球蛋白8:。https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01589

Ayyar BV,Arora S,Ravi SS(2017)优化抗体表达:螺母和螺栓。方法116:51-62。https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2017.01.009

CRIVIANU-GAITA V,THOMPSON M(2016)适体,抗体SCFV和抗体FAB'片段:概述和比较三种最通用的生物传感器生物释认元素。生物传感器和生物电子85:32-45。https://doi.org/10.1016/j.bios.2016.04.091

黄志明(2004)抗原、免疫原、疫苗与免疫。:免疫学指南。爱思唯尔,pp 17-45。https://doi.org/10.1016/B978-012198382-6/50026-1

王R,Xiang S,Feng Y,Srinivas S,Zhang Y,Lin M,Wang S(2013)在大肠杆菌中的功能SCFV抗体的工程生产通过共同表达分子伴侣SKP。前细胞感染微生物3:。https://doi.org/10.3389/fcimb.2013.00072

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