抗体101:抗体入门

通过读经文温斯坦

你可能在新闻里或实验室里听到过抗体这个词。但抗体到底是什么?免疫系统的一个组成部分如何作为研究试剂有用?让我们来看看!

什么是抗体?

抗体,也称为免疫球蛋白,是一种约150 kDa的y型蛋白质,它既是免疫系统的天然组成部分,也是一种可用于各种研究应用的工具。在免疫系统中,抗体由B细胞产生。它们与寄生虫或微生物等细胞外病原体表面的蛋白质或已被微生物感染的细胞表面表达的蛋白质结合,从而触发清除这些感染的免疫级联。任何在免疫系统中产生抗体反应的物质都被称为抗原。

抗体结合蛋白质的能力对于研究应用也很有用,因为它们使科学家能够瞄准他们感兴趣的特定蛋白质。一旦一种蛋白质被抗体瞄准,你就可以通过荧光或化学发光来观察该蛋白质,将蛋白质沉淀出溶液,或分离表达该蛋白质的细胞。继续阅读,了解更多关于抗体的知识,以及如何在实验室中使用它们!

抗体的一部分

抗体有两个区域:Fab(抗原结合区)和Fc(可结晶区)。每个抗体分子由两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链组成。Fc区域和部分Fab区域由Ig重链构成,其余Fab区域由Ig轻链构成。重链和轻链的可变区决定了抗体识别和结合的抗原。

抗体示意图。两条重链形成一个Y形,而两条较短的轻链紧挨着Y形的每个分支。抗原结合位点包括Y形顶部的轻链和重链。抗体的顶部是Fab结构域,底部是Fc结构域。
图1:抗体包含Fc, Fab,重链,轻链,恒定区,可变区标记图

重链的固定区域决定了抗体的同型,即五大类抗体(IgM、IgD、IgA、IgG或IgE)中的一种。在免疫系统中,每种同型在免疫反应的不同时间表达,并启动不同的免疫级联。在研究环境中,不同同型的抗体可以在同一实验中一起使用,因为用于检测抗体存在的试剂部分依赖于其同型。

抗体的可变区不能识别目标蛋白的全部:相反,它能识别蛋白质的一小部分,称为表位。表位在5-8个氨基酸之间,典型长度为5或6个氨基酸(Cruse et al., 2004)。因为蛋白质比这个大得多,它可能包含许多抗体可以识别的表位。想象你正在做一个单词搜索谜题。您并不总是能够立即发现整个长单词,但您可能会看到一些字母,并能够猜出这串字母是否是您要搜索的单词的一部分。抗体可以识别线性化的氨基酸序列,或仅在其三维构象。

抗体的类型和产生

在免疫系统中,抗体由B细胞产生。但是,实际上有很多方法可以产生抗体用于研究目的,其中一些利用了自然免疫系统的产生和更多的工程方法。每种抗体和生产策略都有各自的优缺点。

多克隆抗体

这些抗体来自动物,如兔子或山羊;给动物注射你想让抗体识别的抗原。这引发了动物体内的免疫反应,它的B细胞会大量产生针对注射的蛋白质的抗体。几周后,从动物身上抽取血液并提取抗体。这些抗体可以识别目标蛋白上的各种表位,因此被称为多克隆。多克隆抗体能够识别目标蛋白上的多个表位,因此具有更强的识别能力。然而,每种动物都会产生针对不同蛋白质表位的抗体,所以很多蛋白质表位之间的变异是一个大问题。

单克隆抗体

另一方面,单克隆抗体是同质的抗体群体,它们都识别目标蛋白的相同的表位。这些抗体通常由杂交瘤产生。杂交瘤是通过将从动物体内提取的注射蛋白抗原的B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的。然后通过限制稀释将杂交瘤亚克隆,从而产生产生单一抗体变异的永久克隆细胞群。由于识别目标蛋白的单个表位,单克隆抗体不太可能与其他类似的蛋白质发生交叉反应。然而,杂交瘤的DNA可能发生小的突变,称为遗传漂变,这意味着随着时间的推移,你期望它产生的抗体不一定是你得到的。

重组抗体

与单克隆抗体类似,重组抗体都是同质的群体。然而,与来自天然免疫球蛋白基因的单克隆抗体不同,重组抗体是基于质粒的。它们的序列可以优化为特异性和敏感性,例如通过改变某些氨基酸来提高其稳定性。此外,向量的选择可以影响抗体的表达水平(Ayyar等,2017)。

查看NeuroMab/Trimmer实验室的重组单克隆抗体。

单链可变片段(ScFv)

Y型igG和单链抗体的对比图。scFV要小得多,只由轻链和重链的可变区域组成。
图2:IgG抗体与单链抗体的比较。

因为整个抗体分子并不需要抗原结合,所以可变区域可以单独结合作为融合蛋白产生的.单链抗体是由重链和轻链的可变区域融合在一起,形成一个能够识别目标蛋白的单一蛋白(Wang et al., 2013)。这些蛋白质也来源于质粒。然而,一个缺点ScFv与整个抗体相比,它们对目标蛋白的亲和力较低(Crivianu-Gaita 2016)。在本文中获得更多关于scfv的细节:抗体101:单链片段变量(scFvs)

Nanobodies

Hcab由Y形重链骆驼抗体组成。相比之下,纳米体只包括可变片段,即Y形顶部的部分。
图3:Hcab和纳米体的比较。

Nanobodies变重链是片段的吗重链骆驼抗体(Hcab) (Arbabi-Ghahroudi等人,2017)。虽然它们是基于美洲驼的免疫系统,合成nanobodies可以用质粒生产合成体,既省时又省钱。纳米体和合成体对它们的目标抗原就像普通抗体一样具有特异性。它们的优势还在于体积小得多,这意味着它们可以识别出全部抗体在物理上无法到达的表位。一个完整的抗体是~150 kDa,而一个纳米体是12-15 kDa。

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抗体的研究应用

你可以使用抗体在各种领域进行实验,包括神经科学免疫学.它们可以用于细胞裂解物、全细胞或组织样本中蛋白表达的定性和定量测量。许多使用抗体的实验使用一种一抗,它识别你感兴趣的蛋白质,以及一种二抗,它识别一抗并提供检测方法。你还需要在你的实验中使用适当的控制来考虑潜在的抗体非特异性结合。让我们深入了解其中的一些应用程序。

免疫印迹

Western blots用于检测含有蛋白质混合物的样品中蛋白质的存在。蛋白质通过SDS-PAGE以分子量为基础分离,然后转移到膜上。加入一种识别目标蛋白的一抗,并在膜上与该蛋白结合。然后,添加一种二抗,使蛋白质可以通过化学发光或荧光检测。Western blot常用于比较不同细胞类型或不同处理条件之间的蛋白表达水平。它们可以被定量使用,如果你也装载了适当的控制,正常化的蛋白质浓度凝胶。要了解更多细节,请查看我们的文章西方印迹的基础知识

蛋白印迹显示GFP和肌动蛋白对照条带。
图4:Western blot显示转染GFP质粒的细胞中GFP的表达。肌动蛋白(Actin)是一种常见的Western blots内对照物,显示在每个孔中添加了类似浓度的细胞裂解液。从图片Sun等人,2010

酶联免疫吸附试验(ELISA)

类似地,ELISA用于检测异种混合物中单个蛋白的存在,例如,细胞裂解液或培养细胞的培养基。ELISA法可定量测定蛋白存在量。反应在96孔板中进行,一、二抗体用于捕获目标蛋白并检测其存在。然后,通过每个井的光量-光密度(OD) -已知和实验井被测量。

为了找到样品中蛋白质的确切含量,你需要将样品与标准曲线进行比较。这条曲线是通过用相同的方法对已知数量的蛋白质进行连续稀释而得到的。根据已知样品的OD值和浓度生成的标准曲线用于计算实验样品中的蛋白质浓度。

免疫沉淀反应

有时,你需要从混合物中提取你感兴趣的蛋白质,而不仅仅是检测样品中蛋白质的存在。抗体也能做到这一点!在这种方法中,与微小的珠子结合的抗体抓住目标蛋白并将其从溶液中拉出来。一旦未结合的蛋白被冲走,目的蛋白将使用低ph缓冲液从珠子和抗体中分离出来。然后,纯化后的蛋白可以用于实验,比较一系列样品中蛋白的相对含量,如Western blots或elisa,或用于其他实验来研究蛋白-蛋白相互作用。

流式细胞术

流式细胞术用于检测整个细胞表面或内部的蛋白质。抗体——通常是一抗偶联到荧光团上,以避免在实验中使用二抗——在混合细胞中孵育。使用荧光标记抗体检测蛋白质的技术称为染色。这组抗体用于识别细胞从混合物中子集感兴趣的和测量的相对数量上您感兴趣的蛋白质或在这些细胞:抗体可以结合蛋白质在细胞表面,或细胞膜可以permeabilized允许绑定到胞内蛋白的抗体。

荧光信号通过流式细胞仪检测,并作为蛋白表达的代理。因为信号来自于抗体-荧光团偶联物,而不是由细胞本身表达,所以你可以在每个面板上研究蛋白质,这有很大的灵活性。流式细胞术的一个优点是能够使用多个荧光信号(多达12个或更多!)来同时测量同一细胞上多个蛋白质表达的相对或绝对量,并在样品之间进行比较。

细胞和组织标记

抗体可以用来观察组织(免疫组化)或细胞(免疫细胞化学)。这可以是装在载玻片上的细胞或组织切片,也可以是整个器官。由于组织结构得以保存,这项技术不仅可以显示特定蛋白质的存在,还可以显示它们在细胞或组织中的定位。类似于流式细胞术,您将使用抗体对一种或多种特定细胞类型的标记物进行染色,以及对您感兴趣的蛋白质,以便最好地将其定位。这些可以用荧光团偶联抗体(即免疫荧光)或酶促比色反应进行可视化。

免疫荧光染色CD31(绿色)、CARD14(红色)和pNFkB(蓝色)重叠在图像左侧。每个单独的频道都显示在右边的面板上。
图5:牛皮癣患者皮损处的CD31(绿色)、CARD14(红色)和pNFkB(蓝色)的免疫荧光染色显示炎症表型。使用未偶联的一抗检测每个蛋白质,然后使用荧光团偶联的二抗或Fab可视化。从图片哈登等人,2014

在活的有机体内使用

为了研究和治疗的目的,抗体可以用来影响细胞进程在活的有机体内,这些被称为功能级抗体。一些研究和治疗用途重叠:抗体可以结合并抑制蛋白质的功能,以阻止其在体内的作用,或者它们可以通过与细胞表面受体结合来激活细胞通路。这些应用通常用于研究信号通路或开发治疗方法。

在实验中,与荧光标记或其他标记结合的抗体可以注射到动物体内,直接标记循环细胞或其他可从血液中获取的细胞。然后,通过抽血或器官采集,可以使用流式细胞术等技术分析标记的细胞。

结论

唷!现在你知道了,抗体可以有很多用途!我希望你能理解目前有多少种抗体,以及它们可以用于多少种不同的研究应用。Addgene的抗体质粒收集包括表达抗体、纳米体和ScFvs的质粒,以及用于开发和生产基于质粒的抗体的工具——我们一直在增加我们的收集!

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引用:

Camelid单域抗体:历史和未来展望。免疫球蛋白8:。https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01589

Ayyar BV, Arora S, Ravi SS(2017)抗体表达优化:螺母和螺栓。方法116:51 - 62。https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2017.01.009

Crivianu-Gaita V, Thompson M(2016)适配体、抗体scFv和抗体Fab片段:三种最通用的生物传感器生物认知元件的概述和比较。生物传感器和生物电子学85:32-45。https://doi.org/10.1016/j.bios.2016.04.091

黄志明(2004)抗原、免疫原、疫苗与免疫。:免疫学指南。爱思唯尔,pp 17-45。https://doi.org/10.1016/B978-012198382-6/50026-1

Wang R, Xiang S, Feng Y, Srinivas S, Zhang Y, Lin M, Wang S(2013)利用分子伴侣蛋白Skp在大肠杆菌中工程表达功能性scFv抗体。前细胞感染微生物3:。https://doi.org/10.3389/fcimb.2013.00072

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