你可能听说过这个术语抗体扔在新闻或在实验室,但究竟什么是抗体,免疫系统的一个组件是如何有用的作为一个研究试剂吗?让我们来看看!
抗体是什么?
也被称为免疫球蛋白抗体,~ 150 kDa, y形的蛋白质都是天然免疫系统的一部分,一个工具,可以用于各种各样的应用研究。免疫系统中B细胞产生的抗体。它们绑定到蛋白质表面的细胞外的病原体如寄生虫和微生物,或表面的蛋白质表达细胞被感染微生物,触发免疫级联清楚这些感染。任何免疫系统产生的抗体反应被称为抗原。
抗体结合蛋白质的能力对于研究应用程序非常有用,因为它们允许科学家针对特定蛋白质他们感兴趣。一旦目标蛋白质的抗体,可以可视化蛋白质通过荧光或化学发光,沉淀的蛋白溶液,或分离细胞表达这种蛋白质。请继续阅读,了解更多关于抗体和如何使用它们在实验室里!
抗体的部分
抗体有两个区域:工厂,或者antigen-binding地区,和俱乐部,或者可结晶的地区。两个免疫球蛋白重链(Ig)和两个搞笑光每个抗体分子链组成。Fc地区和工厂的一部分地区是由Ig重链,和其余的工厂区域完成的搞笑光链。变量的区域重和轻链确定抗原抗体识别和结合。
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| igure 1:抗体的标记图包括Fc、外事局,重链,轻链,恒定区、变量地区 |
重链的恒定区决定了抗体的同形像,5个大类的抗体(IgM IgD, IgA、免疫球蛋白或IgE)。在免疫系统中,每个同形像在不同的时间表达的免疫反应,启动不同的免疫级联。在研究环境中,可以使用不同的同形像的抗体在同样的实验,因为试剂用于检测抗体的存在一定程度上取决于其同形像。
抗体的可变区不能识别目标的全部蛋白质:相反,它认可的一小部分蛋白质,称为一个表位。抗原表位是5 - 8之间的氨基酸长,一个典型的长度5或6氨基酸(克鲁斯et al ., 2004)。因为蛋白质是比这更大,它可能包含许多抗体可以识别的抗原表位。想象你正在做一个单词搜索难题。你并不总是会发现整个,长词马上,但你可能会看到一些字母和能够猜字母的字符串是否你正在寻找这个词的一部分。抗体可以识别一个线性化的氨基酸序列,或者只在他们的三维构象。
类型的抗体和生产
在免疫系统中,B细胞产生的抗体。但是,实际上有很多方面可以产生抗体的研究目的,其中一些利用自然免疫系统生产和更多的设计方法。每种类型的抗体和生产策略相比有其优点和缺点。
多克隆抗体
这些抗体是来源于动物,比如兔子和山羊;动物注射抗原抗体识别。这会触发免疫反应在动物,它的B细胞产生抗体注射蛋白质。几周后,血液的动物画和提取的抗体。这些抗体识别各种目标蛋白抗原表位,所以他们被称为多克隆。多克隆抗体有更强劲的优势识别靶蛋白,因为抗体识别多个蛋白质抗原表位。然而,每个动物会使抗体不同蛋白质抗原表位和可变性之间很多是一个大问题。你可以找到关于多克隆抗体对我们的更多细节101年抗体:多克隆抗体博客文章。
单克隆抗体
另一方面,单克隆抗体是一个同质人口相同的抗体识别抗原决定基的目标蛋白质。通常这些抗体产生杂种细胞。杂种细胞是由B细胞融合形成的,从动物注射蛋白质抗原骨髓瘤细胞。然后通过限制稀释subcloned杂种细胞,产生无限增殖,克隆的细胞产生一个变异的抗体。单克隆抗体交叉反应不太可能与其他类似的蛋白质由于识别单个目标蛋白的抗原决定基。然而,小杂种细胞的DNA的突变可以发生,称为遗传漂变,也就是说,随着时间的推移,你期望它产生的抗体是不一定你得到什么。了解更多关于单克隆抗体在这里。
重组抗体
类似于单克隆抗体,重组抗体是一个均匀的人口。但是,与单克隆抗体,它来自自然产生的免疫球蛋白基因,重组抗体plasmid-based。他们可以优化序列特异性和敏感性,例如通过改变某些氨基酸来提高其稳定性。此外,向量的选择会影响抗体的表达水平(Ayyar et al ., 2017)。
单链可变片段(ScFv)
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| 图2:免疫球蛋白抗体和scFv之间的比较。 |
因为整个抗体抗原结合分子是没有必要的,变量的区域就可以作为一个融合蛋白生成。变量的ScFv由地区的重型和轻型链融合在一起形成一个单一的蛋白质,可以识别靶蛋白(王et al ., 2013)。这些蛋白质也plasmid-derived。然而,一个缺点ScFv是他们的低亲和力的靶蛋白相比,整个抗体(Crivianu-Gaita 2016)。在本文中得到更多细节ScFvs:抗体101:单一链片段变量(scFvs)。
Nanobodies
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| 图3:比较Hcab和nanobody。 |
Nanobodies变量重链片段吗重链抗体骆驼科(Hcab) (Arbabi-Ghahroudi et al ., 2017)。尽管他们在骆驼的免疫系统的基础上,合成nanobodies或synbodies,可以从质粒产生,节省时间和金钱。Nanobodies和synbodies规范一样具体的目标抗原抗体。他们也有明显的优势较小,这意味着他们可以识别抗原表位,全抗体不会身体能够达到。虽然一个完整抗体~ 150 kDa, nanobody是12 - 15 kDa。
研究应用抗体
您可以使用抗体实验等多种领域神经科学和免疫学。他们可以用于定性和定量测量的蛋白质表达在细胞溶解产物,整个细胞或组织样本。许多实验,使用使用主要抗体,抗体识别您感兴趣的蛋白质,和二次抗体识别的主要抗体,并提供检测的方法。你也会想要使用适当的控制实验占潜在的非特异性结合的抗体。就让我们一探究竟吧,看一看其中的一些应用程序。
免疫印迹
西方的屁股从样品用来检测蛋白质的存在包含蛋白质的混合物。根据分子量的蛋白质分离通过sds - page,随后转移到膜。主要抗体识别感兴趣的蛋白质添加,并将结合在膜蛋白质。然后,添加二次抗体可以检测到的蛋白质化学发光或荧光。西方的屁股经常用于比较相关的蛋白表达水平之间的细胞类型或治疗条件。他们也可以定量,如果你使用加载合适的规范控制蛋白质的凝胶浓度。得到更多的细节,看看我们的文章西方墨点法的基础知识。
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| 图4:免疫印迹显示绿色荧光蛋白表达在细胞转染质粒编码绿色荧光蛋白。肌动蛋白,一个共同的内部控制对于西方的屁股,显示一个类似的细胞溶解产物浓度添加到每个。从图片太阳et al ., 2010。 |
酶联免疫吸附试验(ELISA)
同样,使用ELISA检测单个蛋白质的存在从异构混合物——例如,细胞从培养细胞溶解产物或媒体。可以使用ELISA定量测量的蛋白质。反应发生在一个96孔板,在初级和二级抗体用于捕获感兴趣的蛋白质和检测它的存在。的光量,可以通过每个——已知的光学密度(OD)和实验井测量。
发现蛋白质的确切数量在你的样本,你将比较样品标准曲线。这条曲线生成使用连续稀释的一个已知数量的蛋白质,也以同样的方式检测。创建的标准曲线OD和已知浓度的样品是用来计算实验样品中蛋白质的浓度。
免疫沉淀反应
有时,而不是检测蛋白质的存在在一个示例中,您想要提取的蛋白质混合物的兴趣。抗体也可以做到这一点!在这种方法中,抗体绑定到微观珠子抓住感兴趣的蛋白质,把它拽出来的解决方案。一旦释放蛋白冲走,感兴趣的蛋白质分离珠和抗体使用低ph值缓冲区。然后,纯化蛋白可用于实验比较的相对数量的蛋白质存在于一系列的样品,如西方的屁股或elisa、或其他实验研究蛋白质-蛋白质之间的关系。
流式细胞术
流式细胞仪是用来检测蛋白质的表面或内部整个细胞。抗体——通常,主要抗体共轭荧光团,避免二次抗体的使用在这个实验中,孵化与细胞的混合物。使用荧光标记抗体的技术来检测蛋白质被称为染色。这组抗体用于识别细胞从混合物中子集感兴趣的和测量的相对数量上您感兴趣的蛋白质或在这些细胞:抗体可以结合蛋白质在细胞表面,或细胞膜可以permeabilized允许绑定到胞内蛋白的抗体。
通过检测荧光信号是流式细胞分析仪和功能作为蛋白表达的一个代理。因为信号来自antibody-fluorophore共轭,不是表达的细胞本身,有很大的灵活性,蛋白质可以在每个小组进行调查。流式细胞术的一个优势是能够使用多个荧光信号(一打或者更多!)测量相对或绝对数量的同时表达多个蛋白质在同一细胞以及样本之间的比较。了解更多关于流式细胞术。
细胞和组织的标签
抗体可用于可视化组织(免疫组织化学)或细胞(免疫细胞化学)。这可能是细胞或组织切片上滑动,或整个器官。因为组织架构是保存,这种技术不仅允许您可视化特定蛋白质的存在,但他们的细胞或组织内定位。类似于流式细胞术,您将使用抗体染色标记的一个或多个特定的细胞类型,以及您感兴趣的蛋白质,以最好的说明其本地化。这些可以使用fluorophore-conjugated抗体(即可视化。免疫荧光),或通过比色反应促进了酶反应。
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| 图5:对CD31免疫荧光染色(绿色),CARD14(红色),和pNFkB(蓝色)在lesional从牛皮癣患者皮肤,显示炎性表型。每个蛋白质检测使用一个非结合的主要抗体,然后使用fluorophore-conjugated可视化二次抗体或工厂。从图片强化et al ., 2014。 |
在活的有机体内使用
为研究和治疗目的,抗体可以用来影响细胞过程在活的有机体内,这些被称为功能级抗体。的一些研究和治疗使用重叠:抗体可以结合并抑制函数体内的蛋白质停止其效果,或者他们可以用来激活细胞通路与细胞表面受体结合。这些应用程序通常用于研究信号通路或发展疗法。
实验、共轭荧光标记抗体或其他标记可以注射到动物,直接标签循环细胞或其他细胞从血液中访问。然后,通过抽血或器官丰收,标记细胞可以使用流式细胞仪等技术进行分析。
结论
唷!现在你知道抗体可以用于很多!我希望你意识到许多类型的抗体,以及许多不同的研究应用程序可以使用它们。Addgene抗体质粒的收藏品包括质粒表达抗体,nanobodies, ScFvs,以及开发和生产工具plasmid-based抗体——和我们总是不断收集!
引用:
Arbabi-Ghahroudi M(2017)骆驼科单极抗体:历史观点和未来前景。Immunol 8:前面。https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01589
Ayyar BV Arora年代,拉维SS(2017)优化抗体表达:螺母和螺栓。方法116:51 - 62。https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2017.01.009
Crivianu-Gaita V,汤普森M(2016)寡核苷酸适配子,scFv抗体,抗体Fab片段:概述和比较三种最多才多艺的生物传感器biorecognition元素。生物传感器和生物电子学85:32-45。https://doi.org/10.1016/j.bios.2016.04.091
克鲁斯JM,刘易斯,王H, Geziena MT,史蒂文通用电气,洛娜j .(2004)抗原免疫原,疫苗和免疫。:免疫学指南。爱思唯尔,pp 17-45。https://doi.org/10.1016/b978 - 012198382 - 6/50026 - 1
王R,香,冯Y,斯年代,张Y,林,王年代(2013)工程的生产功能scFv抗体共同表达于大肠杆菌分子伴侣蛋白Skp。细胞感染Microbiol 3:前面。https://doi.org/10.3389/fcimb.2013.00072
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