抗体101:单链片段变量(scFvs)

由贝丝学会主席

提到抗体,你可能会想到单克隆抗体(mAbs)。自1975年以来,由于诺贝尔奖获奖的工作Milstein和科勒谁开发了杂交瘤技术。但单链片段变量(SCFV)呢?在1988年,SCFV在1988年被两个单独的实验室克隆(Bird等人,1988年Huston等人,1988).SCFV是可以结合抗原的抗体分子的最小单位。虽然它们似乎不熟悉,但SCFV通常是工程蛋白的构建块。所以让我们熟悉SCVS。

什么是scFv?

scFVs是一种重组抗体。它们是一种含有变轻链(VL)和变重链(VH)的~25 kDa单链多肽抗体.这两条链通过通常的柔性接头肽连接15-20氨基酸长长并由甘氨酸和丝氨酸组成使用分散的亲水残基来增加溶解度(Monnier等,2013)。该连接体使一个可变结构域的c端和另一个可变结构域的n端保持一定距离,有利于抗原结合位点的适当折叠和形成,同时也最大限度地减少单链抗体的低聚化。虽然你可能认为单链抗体的可变结构域会反映抗体(vl -link - vh),但vl -link - vh和vh -link - vl结构域都可以产生功能性单链抗体;然而,一些单独的SCVS在一个配置中执行比另一个配置更好(Sandomenico等人,2020年)。

将IgG与SCFV进行比较的原理图。SCFV要小得多,包括轻质和重链的可变区。
图1:IgG抗体与单链抗体的比较。

单克隆抗体与单克隆抗体相比有哪些优点和缺点?

scFvs的优点:

scFv的优势在于其规模。由于scFvs可以在细菌中表达,所以小的scFvs更容易制造,成本也更低,而单克隆抗体通常需要哺乳动物表达系统。scFvs也足够小,可以用于筛查体外显示方法如噬菌体展示(Bradbury等,2011)。体外选择避免了动物免疫,也允许产生针对两种抗原的scfv,而这两种抗原是不可能产生scfv的体内:在体内或自抗原中发现的抗原,以及动物致死的毒素。

在诊所,SCFV的大小也提供抗体的优势(Ahmed等人,2012Bates和Power。,2019年):快速血液清除,有助于成像应用;更好的组织穿透,有助于治疗和成像应用;并降低了免疫原性体内因为他们没有Fc区域

缺点scFVs:

与抗体相比,scFvs倾向于具有较低的亲和力,较低的长期稳定性,并且由于其体积小而更容易聚集(Bates和Power。,2019年).它们的快速间隙可以是治疗应用的缺点,其中保留时间更长的保留时间往往增加治疗效果(Ahmed等人,2012).

如何生成scFv?

传统上通过扩增vland vh抗体序列来克隆SCFV序列杂交瘤但是,噬菌体展示是一种生成SCFV的流行方式。

噬菌体展示是将scFvs的集合库显示在噬菌体的外壳上,这是一个连接基因型和表型的过程。将噬菌体展示库与平板结合抗原孵育有助于选择高亲和力scFvs。然后,结合噬菌体通过感染细菌进行增殖,以进行额外的淘洗和scFv鉴定。

噬菌体显示器的阶段包括与抗原,洗涤和增殖结合噬菌体的结合。
图2:噬菌体显示以池的SCVS库展示,噬菌体涂层上显示。该库与板式抗原一起孵育,以选择具有高亲和力结合的SCFV。然后通过感染细菌进行额外回合筛选的细菌来增殖结合的噬菌体。使用biorender.com创建。

一些噬菌体展示来自免疫动物的B细胞的文库筛选抗体基因,但是可以通过使用半合成或完全合成的VL和VH序列来避免动物使用。噬菌体展示还允许筛选从患病或疫苗接种的人的B细胞抗体基因产生的SCFV。

如何生产scFvs?

虽然可以在哺乳动物,酵母,植物和昆虫细胞中产生SCFV,但它们通常从细菌中的质粒表达(Ahmed等人,2012).细菌表达的一个挑战是VL和VH结构域之间的二硫键的适当形成。该键为SCFV提供稳定性和溶解度(Gaciarz和Ruddock。,2017年),但需要氧化环境才能形成。当scFvs在细菌的非氧化细胞质中表达时,scFvs在不溶性包涵体中积累。虽然可以从包体中重新溶解和折叠scFvs,但这是费时费力的。

为了避免这种情况,这些方法中的一种或多种通常用于细菌中的SCFV表达:

  1. 以氧化的细菌周质为靶点,允许适当的二硫键的形成。
  2. 在氧化还原突变菌的菌株中表达所以它们有更氧化的细胞质。
  3. 在分子伴侣存在下表达,可以帮助SCFV在细胞质中适当折叠(Sandomenico等,2020年).
  4. 转换到一个半胱氨酸自由格式在细胞质中更容易表达大肠杆菌,虽然所有SCFV都无法实现这一点。

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scFvs的用途是什么?

scFvs的使用方式和抗体一样多。scFvs甚至被用来筛选新的抗体。为此,抗体可变结构域序列被表达为scFvs,并用scFvs进行筛选体外选择坚固粘结剂的试验。然后将所选单链抗体可变域的序列插入到编码抗体常数域支架的载体中,将单链抗体转化为抗体。

将SCFV与其他蛋白质结构域组合的能力,就像乐高碎片一样,使它们比抗体更适合用作工程蛋白的构建块。这种灵活性主要是由于SCFV小于抗体。SCFV通常遗传地融合到其他蛋白质中,这导致了它们对基本和翻译研究的应用。

scFvs的基础研究应用:

  • SunTag系统使用scFv放大标记蛋白的荧光强度。SunTag有两个组成部分:1)一个有10-24个短表位GCN4拷贝标记的蛋白质,也称为支架;2)与GCN4结合的scFv与GFP融合。当scFv-GFP融合物的多个拷贝与SunTag支架结合时,荧光信号的强度会增强,并使活细胞中的单分子跟踪成为可能。
  • HA frankenbody是HA标签检测探针。它包含一个ha结合的scFv,它与荧光蛋白融合,比如GFP。HA frankenbody的工作原理就像基于抗体的探针,但由于它是基因编码的,因此更容易和更便宜地产生。

scFvs的翻译应用:

  • 就像抗体一样,有许多基于scfv的疗法正在临床试验或已经在临床(Bates和Power。,2019年).许多设计用于肿瘤学应用的scFvs被重新格式化为结合CD3和肿瘤特异性抗原的双特异性分子。当这些被称为双特异性T细胞受体(BiTE®s)的分子结合T细胞和肿瘤特异性抗原上的CD3时,它将T细胞带到肿瘤部位。ScFvs还可以与细胞毒素、放射性同位素、细胞因子和酶融合,用于癌症、自身免疫和/或炎症治疗。抗体片段(如scFvs)也用于眼病,如老年性黄斑变性(AMD),因为眼内定向注射可导致眼内药物浓度高,而对全身的副作用很小。
  • SCFV是设计的一部分嵌合抗原受体.CAR - T是scFvs和T细胞受体的嵌合体,在T细胞上表达,形成CAR - T细胞。细胞外的scFv受体部分识别感兴趣的抗原,而胞内的T细胞受体部分促进信号转导和从T细胞释放细胞毒性颗粒。当CAR具有与癌症相关抗原结合的scFv时,结合受体的scFv部分可以激活T细胞杀死癌细胞。
  • scFv的小体积也允许它们通过像AAV这样的病毒载体传递,这可能对传递很有用vwin668抑制HIV的scFvs。

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引用和资源

参考:

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关键词:大肠杆菌,抗体,重组片段,表达系统IJMS 21:6324。https://doi.org/10.3390/ijms21176324

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  • 读到frankenbodies,一种基于抗ha scfv的荧光成像探针。
  • 学习更多关于抗体
  • 阅读关于另一种用于抗体的试剂共享平台,杂交瘤发育研究银行
  • 了解更多有关SunTag该系统使用scFv放大标记蛋白的荧光强度。

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主题:抗体

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