避免荧光蛋白与mOX FPs融合的暗面

由Guest Blogger.

这篇帖子由博客埃里克L.Snapp和Lindsey M. Costantinini提供贡献。

"你低估了黑暗面的力量"

- “jedi返回”中的达尔斯蒂勒

虽然Vader指的是一个神秘的邪恶方面力量,“此报价同样适用于许多显微镜实验vwin德赢娱乐平台(FPS)本地化为除细胞质以外的隔间。这是,不幸的是,一些调查人员意识到他们对暗,非荧光和错误的FP-Fusions对定量成像实验和细胞生理学的影响令人意识到。

下载荧光蛋白101电子书vwin德赢娱乐平台 荧光蛋白融合的陷阱

克隆FP融合后第一次观察明亮的信号,因为您喜爱的兴趣蛋白质是令人兴奋和奖励。但是,如果与常规内质网(ER)蛋白质掺入细胞质的FP融合是什么?或者更令人不安,如果融合蛋白分子的显着分数不能正确折叠何种很大程度量?错误折叠的fps不发荧光。黑暗群体不容易明显,并且可以混淆定量成像实验或甚至产生负面影响细胞(参见图1)。

荧光蛋白错误折叠和二硫键形成导致无功能荧光蛋白

当表现正常时,FPs使研究人员能够研究活细胞中荧光蛋白融合的定位和动力学在真正的时间。以前,我们已经描述了许多应该考虑的实际考虑因素,当决定在融合构造中放置FP [12],即对靶向靶向序列的FP序列定位,其通常具有绝对位置要求。例如,kdel检索序列仅在极端c-terminus上的函数[3.]。因此,你必须决定你的克隆策略并决定是否根据您的实验需求创建一个N-或C终端融合。

同样重要的是,在克隆之前,您必须考虑您的FP是否在其本地化的环境中运行4.]。大多数研究者惊讶地发现FPs通常不适合细胞质以外的细胞隔间。一般来说,FPs是在细胞质环境中进化或被设计用于细胞质环境。然而,大约40%的人类(和大多数真核生物)蛋白质定位于化学上不同的亚细胞环境,包括构成分泌途径,内吞囊泡,线粒体,溶酶体或它们的细胞器分泌到细胞外环境中。这些隔间内的许多驻留蛋白质经历显着的翻译后修饰,包括糖基化,二硫键形成和蛋白水解裂解。本地化为细胞器的FPS同样易于这些非天然修改,这可能会影响功能[5.]。我们和其他人报告称FP半胱氨酸残基在分泌途径中形成不恰当的二硫键(图1)[4.6.-8.]。此外,编码n -糖基化一致序列的FPs被添加n -聚糖修饰[9.]。这两种后期修饰都可以破坏折叠蛋白质非荧光的FP折叠。

不幸的是,累积的错误折叠和无官能(暗)荧光蛋白不能被忽略。vwin德赢娱乐平台它们有可能干扰驻留态伴侣的功能,并且可能会影响细胞功能或可能的活力。FP错误折叠甚至可以破坏融合蛋白定位。例如,在FPS之间形成不恰当的链间二硫键块,块GOLGI复合局部化融合从正确离开ER和荧光(见图2)[5.]。当使用含有两个半胱氨酸残基的FPS和旨在将它们定位到分泌途径的序列时,可以用免疫荧光检测对ER的误报的暗池。这种黑暗的融合群可能被错误折叠,阻止通过分泌途径,并保留在ER中。

FPs无可否认是一种强大且成功的工具,它使得许多细胞生物学分析成为可能。然而,有一种普遍的观点认为,细胞中的大多数FPs会折叠,其荧光模式等同于fp融合蛋白的分布。我们的研究和其他人的研究(5.6.7.10.11.)强调了错误折叠暗FP融合的真实后果,包括错误的融合蛋白水平定量。目前尚不清楚FP错误折叠是否影响融合蛋白功能,从而导致对融合蛋白活性的过高或过低估计。我们鼓励研究人员对fp融合蛋白的功能特征进行描述,这些特征相对于未标记的感兴趣蛋白。为了避免深色荧光蛋白在您的实验中积累,请考虑以下几点:vwin德赢娱乐平台

如何确保FP与非细胞质蛋白的融合正常发挥作用?

MOX GFP在Golgi Complex中我们建议从使用新出版的开始FPS的氧化优化调色板(MOXFPS)[5.]。MOXFPS克服了流行荧光蛋白的固有问题,通过在流行的FPS中突变半胱氨酸残基和N-糖基化共有序列来重新设vwin德赢娱乐平台计。这产生了惰性的调色板绿色青色黄色的,蓝色的可用于各种组合的变体。例如,对于标准荧光显微镜滤波器组,用户可以用绿色和蓝色或青色和黄色MOXFPS的组合标记感兴趣的多个蛋白质。Moxfps的固有亮度和光谱特性与非优化的父母蛋白质相当。我们最近的出版物示出了利用优化的MOXFP而不是标准FPS实现的荧光信号的定量增加。信号的增加不是由于FP更亮,而是由于大多数情况下,如果不是全部,则是由于FP融合的正确折叠和荧光团形成。

我们的MoxFP目前代表了在包括分泌途径(图2),线粒体和叶绿体的内膜空间,细胞外环境和革兰氏阴性细菌周装的各种细胞室中成像的最惰性解决方案之一。努力标记内源性基因的蛋白质在这些隔间使用CRISPR由于上面列出的原因,系统应该强烈考虑使用标准FPS的Moxfps。此外,由于MOXFPS是高度单体的,它们是具有整体膜蛋白和膜相关蛋白(即GPI锚定蛋白)的融合的绝佳选择,这更容易受到许多标准FPS的低聚作用。Moxfps现在可以通过addgene获得


非常感谢我们的客人博客埃里克L.Snapp和Lindsey M. Costantini!

Erik Lee Snapp.Erik Lee Snapp在俄勒冈州卫生科学大学的分子微生物学和免疫学中获得了他的博士学位,他的博士后奖学金与詹妮弗·莱宾·施瓦茨(Jennifer Lippincott-Schwartz)是国家卫生研究院,他目前是Albert Einstein医学院副教授在解剖学系和结构生物学。他的兴趣包括内质网和活细胞成像方法中分泌蛋白质的质量控制。Erik也是狂热的长途跑步者,加德纳和厨师。


Lindsey CostantiniLindsey M. Costantini从Albert爱因斯坦医学院获得了她的生物医学研究博士学位。她的博士研究是在Erik Lee Snapp的实验室进行的,专注于优化亚细胞环境的荧光蛋白。vwin德赢娱乐平台目前,她是北卡罗来纳大学的北卡罗来纳大学的尖顶博士博物馆。在共同委员会盛开的达巴尼亚和杰克格里菲斯,她的研究重点介绍了Kaposi的肉瘤相关的Herpesvirus的复制机械。

参考文献

1.Snapp,Erik。“细胞生物学中荧光融合蛋白的设计与使用。”细胞生物学的当前协议(2005):21-4。PubMed.PMID:18228466。pmed中央PMCID:PMC2875081.

2。Snapp,埃里克·李。荧vwin德赢娱乐平台光蛋白:细胞生物学家的使用指南细胞生物学的趋势19.11(2009): 649 - 655。PubMed.PMID:19819147。pmed中央PMCID:PMC2784028.

3.Munro,Sean和H. R. Pelham。“使用肽标记来检测从克隆基因表达的蛋白质:删除果蝇Hsp 70的映射功能域。”盟军杂志3.13(1984年):3087. PUBMEDPMID:6526011。pmed中央PMCID:PMC557822

4。Costantini, Lindsey M.和Erik Lee Snapp。细vwin德赢娱乐平台胞器中的荧光蛋白:严重的缺陷和一些解决办法。DNA和细胞生物学32.11(2013):622-627。PubMed.PMID:23971632。pmed中央PMCID:PMC3806368

5。Costantini,Lindsey M.等人。“针对多种细胞环境优化的荧光vwin德赢娱乐平台蛋白的调色板。”自然通信6(2015)。PubMed.PMID:26158227。PubMed Central Pmcid:PMC4499870。

6. Jain,R.等人。“内分泌细胞分泌途径中绿色荧光蛋白的低聚。”物化学。J360(2001): 645 - 649。PubMed.PMID:11736655。pmed中央PMCID:PMC1222268

7. Aronson,Deborah E.,Lindsey M. Costantini和Erik L.Snapp。“通过SEC转换器针对时,超级折叠器GFP在氧化环境中是荧光的环境。”交通12.5(2011):543-548。PubMed.PMID:21255213。pmed中央PMCID:PMC3079558

8。Suzuki,Takahisa,等。“氧化环境的无半胱氨酸荧光蛋白的发展。”vwin德赢娱乐平台普罗斯一体7.5 (2012): e37551。PubMed.PMID:22649538。pmed中央PMCID:PMC3359384

9. Costantini,Lindsey M.等人。“胱斯坦无糖基化的单体蓝色荧光蛋白,SECBFP2,用于真核生物分泌途径的研究。”生物化学和生物物理研究通信430.3(2013):1114-1119。PubMed.PMID:23257162。pmed中央PMCID:PMC3552020

10.Paladino,Simona,等。“蛋白质寡聚化调节GPI锚定蛋白的筏分配和顶端分选。”细胞生物学杂志167.4(2004):699-709。PubMed.PMID:15557121.pmed中央PMCID:PMC2172584

11. Jokitalo,Eija等人。“Golgi集群和囊泡独立于内质网的介导遗传。”细胞生物学杂志154.2(2001):317-330。PubMed.PMID:11470821。pmed中央PMCID:PMC2150754

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