四个基本编辑记者监控和丰富实时编辑

由Alyssa Cecchetelli.

基础编辑器在基因组中创建特定点突变,但与其相比,它们效率低下CRISPR / CAS9.依赖于双链DNA断裂的编辑。由于这种低效率,科学家不仅要容易识别,更重要的是基本编辑在他们的实验中,实时事件也丰富了碱基编辑细胞。在过去的几年里,科学家们创造了一系列的碱基编辑记者,可以帮助你做到这一点。

实时监控Apobec和Cas9介导的编辑

哈里斯实验室创建高手,一位监控的记者apobec(一家胞苷脱氨酶蛋白质)和Cas9介导的编辑实时(St. Martin等,2018)。ACE报告基因是一个双反子结构,由一个突变的mCherry和一个下游的构成型活性eGFP组成。为了创造不活跃的mCherry,实验室引入了一个43个碱基对的插入,由于帧移而破坏荧光。荧光恢复只能通过apobecn - cas9n - ugi复合体的编辑进行。那么这到底是如何工作的呢?

APOBEC和cas9介导的编辑报告原理图。报告基因由一个突变的mCherry基因和一个构成型活性eGFP组成。密码子59环的碱基编辑恢复了mCherry蛋白,并导致了mCherry蛋白的表达。
图1:APOBEC和cas9介导的编辑(ACE)报告者的作用。图片来自圣马丁等人。,2018年

apobec-cas9n-ugi靶向其优选的三核苷酸基序(5'-tca-tua),其在43碱基对Mcherry插入中发现。编辑这些图案产生病变,这些病变受到典型基础切除修复酶的切除和SSDNA切​​割。同时Cas9n切割相对的DNA菌株,这导致两种DSB,其可以通过NHEJ恢复MCHERRY表达修复。然后可以使用荧光激活的细胞分选(FACS)来分类细胞,并且通过将表达EGFP表达的细胞与表达EGFP和MCHERRY的细胞进行比较,可以容易地确定编辑效率。ACE用于识别已成功编辑Apobec3a和apobec3b的细胞(圣马丁等,2018)。

TLDR哈里斯实验室的ACE记者依赖于恢复mCherry的帧移,恢复荧光以监测apobecs - cas -9介导的编辑。

Apobec-Cas9的单个基本编辑的EGFP记者

尽管ACE报告者实时量化了apobecc - cas9的效率,但它依赖于DSBs,这对于监测单碱基编辑并不理想(St. Martin等人,2018年)。

为了避免测序和之前的记者需要DSB,哈里斯实验室创建了一个小组eGFP记者量化目标DNA编辑效率apobec1 - cas9编辑复合物的实时检测(St. Martin等,2019)。为了创建eGFP报告基因,Harris实验室分别突变了eGFP中的三个密码子以消除荧光。这创造了三名灭活的EGFP记者—eGFP L202、eGFP L138、eGFP L93。

将修饰后的eGFPs置于野生型mCherry和T2A位点下游,并在细胞中表达。mCherry的组成性表达用于鉴定成功转染的细胞。apobecl - cas9编辑体的C-to-T编辑可以恢复eGFP荧光,通过将eGFP和mCherry阳性细胞的数量除以仅mCherry阳性细胞的数量,可以方便地量化单基编辑效率(Martin et al., 2019)。

根据使用的gRNA, eGFP碱基编辑报告显示出不同的编辑百分比
图2:使用基本编辑器编辑效率。图片来自圣马丁等,2019年

Harris实验室使用这些eGFP记者分析了7种人类APOBEC3蛋白的碱基编辑能力,发现APOBEC3A和APOBEC3bctd是最高效的(Martin et al., 2019)。

TLDR:来自哈里斯实验室的EGFP记者避免了DSB在监测Apobec-Cas9 eDitisome复合物的目标DNA编辑效率方面的需求。EGFP记者依赖于EGFP中的点突变的校正导致荧光的恢复。

编辑浓缩瞬时报告器(TREE)

布拉夫曼实验室开发了一种暂记者编辑浓缩(树)纯化单基编辑细胞无需单晶体隔离和下游测序(常务贝尔等,2019)。树是一个实时,基于荧光的识别系统,用于隔离基础编辑的细胞群。

为了开发这种方法,实验室的灵感来自于使用整合的GFP报告,转化为BFP(蓝色荧光蛋白)的CRISPR/Cas9同源定向修复(HDR) (Glasser等,2016)。对于TREE,他们设计了一种BFP变体,该变体在胞苷脱氨酶碱基DNA编辑器的作用下转化为GFP。具体来说,BFP突变体(BFPH66)在氨基酸66处含有组氨酸。这个组氨酸由一个' CAC '密码子编码,在C-to-T碱基编辑事件后被转换为' TAC '或' TAT '。这种编辑将组氨酸变为酪氨酸,产生GFP变体(GFPY66),该变体具有位移的发射光谱。因此,一个成功的碱基编辑事件将导致GFP荧光可以通过流式细胞术可视化和分类。

显示基础编辑将表达质粒的蓝荧光蛋白转化为表达绿色荧光蛋白的基础编辑。
图3:靶向PEF-BFP与胞苷脱氨酶碱基编辑器导致来自BFP到GFP的发射光谱的变化。图片来自Storeage-Beier等,2019年

该团队通过用BFP变体、BE4am-Cas9碱基编辑器和sgRNA载体感染HEK-293细胞,以实现BFP-to- gfp转换,并靶向基因组中的特定位点,对TREE进行了测试。Wang和Brafman实验室表明,用TREE分离的GFP阳性细胞与仅通过转染报告物分离的细胞相比,有显著更高的基因组碱基对编辑频率,后者只报告了质粒传递到细胞的效率。相比之下,TREE为质粒传递和随后的碱基编辑效率提供了读出。

TLDR:来自Wang和Brafman实验室的TREE使用了一个经过改造的BFP变体,该变体在碱基编辑事件后转换为GFP。与单独转染的细胞相比,GFP阳性细胞可以被分类,并有明显更高的碱基编辑频率。

“基因”(GO) - 一个功能报告系统,用于识别和丰富基础编辑活动

上述记者依赖于GFP荧光和细胞分选使用FACS来分类,这可能会限制在不同细胞类型和系统上的使用。

引入灵活性,陶氏化学实验室创建了一个基本编辑报告Eatects并为Vivo中的基础编辑事件而丰富而不仅仅依赖于GFP(katti等,2020)。他们把这个记者命名为“基因”或去。通过影响不同报告蛋白的蛋白翻译来进行工作。蛋白质翻译需要八卦的起始密码子立即在Kozak序列的下游。Dow实验室假设,如果它们使用基础编辑器(C> T转化)从ACG密码子创建ATG密码子,它们可以诱导任何可检测蛋白质的翻译,而不仅仅是荧光蛋白。vwin德赢娱乐平台

Gene On中的报告基因由mScarlet报告基因、荧光素酶报告基因和新霉素耐药性报告基因组成,其表达依赖于碱基编辑。
图4:基因中的记者包括Mscarlet报告者,荧光素酶报告和新霉素抵抗记者。图片来自卡蒂等人,2020年

作为概念的证明,陶氏实验室用GFP荧光检验了他们的假设。为此,他们生成了一个沉默的GFP结构,其中包含一个ACG起始密码子突变,并将其整合到表达Cas9或优化胞苷碱基编辑器的人类和小鼠细胞中。然后实验室将一种针对GFPACG的sgRNA引入细胞。正如预期的那样,只有包含胞苷碱基编辑器的细胞表现出GFP荧光的强劲诱导,证实了氧化石墨烯作为碱基编辑报告物的有效性。

由于起始密码子ATG处的蛋白质翻译起始具有通用性,陶氏实验室成功地利用GO诱导了一系列不同的报告基因的翻译,包括mScarlet-I、荧光素酶、抗生素抗性标记以及crea -重组酶等其他酶的翻译,极大地扩大了碱基编辑报告基因工具箱。陶氏实验室也证明了GO是一个有效的记者腺嘌呤基编辑,使A-to-G编辑基因组(高德利等,2017)。因此,氧化石墨烯是一种灵活和适应性强的工具,可用于识别和丰富体内碱基编辑事件。

TLDR:来自道德实验室(GO)的基因是一个灵活的报告系统,用于体内编辑事件。由于依赖于突变开始密码子的校正以引发蛋白质表达,它可用于可检测蛋白质的阵列,包括荧光蛋白,抗生素抗性和荧光素酶。vwin德赢娱乐平台

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参考文献

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Katti A,Fouronda M,Zimmerman J,Diaz B,Zafra MP,Goswami S,Dow Le(2020)Go:一个功能报告系统,用于识别和丰富基本编辑活动。核酸研究48:2841-2852。https://doi.org/10.1093/nar/gkaa124

Martin AS, Salamango DJ, Serebrenik AA, Shaban NM, Brown WL, Harris RS (2019)科学报告9:。https://doi.org/10.1038/s41598-018-36739-9.

St. Martin A, Salamango D, Serebrenik A, Shaban N, Brown WL, Donati F, Munagala U, Conticello SG, Harris RS(2018)用于活细胞中apobecc - Cas9编辑或Cas9切割DNA的定量和富集荧光报告。核酸研究46:e84-e84。https://doi.org/10.1093/nar/gky332

Standage-Beier K, Tekel SJ, Brookhouser N, Schwarz G, Nguyen T, Wang X, Brafman DA(2019)人类细胞编辑富集(TREE)的临时记者。核酸研究47:e120-e120。https://doi.org/10.1093/nar/gkz713

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