通过化学和小分子荧光团更好地染色

客人的博客

这篇文章由Guest Blogger提供贡献,路加福音Lavis她是霍华德休斯医学研究所Janelia研究校园的组长。

化学已死,化学万岁!

发现绿色荧光蛋白引发了生物成像的复兴。突然之间,细胞生物学家不再依赖于化学家和(昂贵的)合成荧光团。通过电震动加入少量DNA,细胞就完全有能力自己合成荧光团融合。后续的发展vwin德赢娱乐平台复制了小分子特有的许多特性:红移光谱,离子敏感,光活化等。这些令人印象深刻的进步引出了一个显而易见的问题:在这个绿色荧光蛋白及其同类的时代,为什么细胞生物学家要和化学家交流?

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原因之一是所谓的“光子预算”:每个样本都有有限数量的荧光团,而每个荧光团在漂白之前可以释放有限数量的光子。人们可以从生物样本中提取的信息量完全依赖于光子预算,而推动荧光显微镜的前沿常常需要更多的光子。例如,从蛋白质融合的瞬时过表达转移到基因编辑的细胞可以减少荧光团的数量,从而减少光子预算。同样地,从集合成像到单分子成像的转换给光子预算带来了更大的负担,光子预算决定了我们可以追踪单个分子的时间和精度。荧光蛋白的光子预算不足是一个普遍的问题——即使是最节俭的细胞生物学家也会感觉像一个大学生在沙发垫vwin德赢娱乐平台上寻找多余的零钱,拼命地从样本中提取更多的光子。

化学荧光团比荧光蛋白更亮,更稳定,提供了一种直接的方法来提高光子预算。vwin德赢娱乐平台当然,“恢复”到小分子染料似乎令人生畏——没有人愿意把他们的时间花在将荧光缀合物显微注射到细胞上。幸运的是,在过去的20年里,聪明的化学家和生化学家已经开发出了一些技术,使化学标记在复杂的生物环境(如活细胞和组织)中更容易、更有效(图1)。化学染料优异的光物理特性与荧光蛋白的易学性和特异性相结合。vwin德赢娱乐平台

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标签- sensing策略

大多数细胞标记策略有两部分:(1)遗传编码的“标签”表示为与您最喜爱的蛋白质的融合和(2)合成荧光团 - 环状的“配体”结合标签。与生物成像中最好的想法一样,提供了用于细胞内标记技术的初始突破钱永健他的研究表明,双砷染料配体(例如FlAsH、ReAsH)和短基因编码的四半胱氨酸(Cys)之间的选择性相互作用4)肽标签可用于标记细胞中的蛋白质(图1一个)。基于此概念开发的其他策略包括:

  • 自我标签标签(例如,SNAP-tag,哈利塔,TMP-tag) - 这些广泛使用的系统由遗传编码的酶变体标签组成,其特异性和不可逆地与附着在荧光团附着的​​小衬底配体基序(图1B)。
  • 工程的连接酶(例如,硫辛酸连接酶,生物素连接酶,磷酸氯乙基转移酶) - 这些酶催化荧光团配体与肽标签的共价附着(图1c)。
  • 点击化学(例如,转基因环丁烯 - 四嗪)-非天然氨基酸可以整合到蛋白质结构中,然后与生物正交化学反应的生长工具箱一起使用(即,点击化学),在特定的整合位点附着一个荧光团(图1d)。
  • 氟原激活蛋白(FAPs)- 这些修饰的抗体片段结合并增强小分子氟化物(图1E)。
  • -这些标签由一个荧光团结合到分子物种,对内源性分子靶标如紫杉醇具有高亲和力。与其他系统不同的是,由于小分子结合基元靶向内源蛋白,因此不需要基因编码的标签(图1f)。

活细胞标签策略

标签策略利弊

所有这些标记策略都在基因编码标签的大小、荧光团附着的速度和选择性、所产生的共轭物的亮度和系统的复杂性之间进行权衡。小分子标记策略的一个特别可取的特性是fluorogenicity,这意味着配体在溶液中显示低荧光,但在与同源蛋白结合时显示高荧光。在某些情况下,这种特性消除了从样品中去除多余染料的需要,这对难以清洗的样品尤其重要,例如完整的组织。一些化学标记策略,如双砷染料(图1a)和FAP系统(图1e)天生具有荧光性,其他一些可以使用环境敏感的荧光团使其具有荧光性。总的来说,自标记标记系统(图1b)可能是活细胞标记的最好方法,而且考虑到系统的相对简单性以及荧光和荧光配体的可用性,自标记标记系统从荧光蛋白转换可能是最容易的。vwin德赢娱乐平台

新的荧光团

作为这些创新标签策略的必然结果,几个团体 - 包括矿山 - 已经重新审视了染料的旧化学。第一个合成染料,柠檬,于1856年被发现威廉佩林。他的发现引发了一系列的活动,大多数经典的小分子荧光团,如罗丹明(图2a),在19世纪被发现th世纪。由于其化学性质、小尺寸、亮度和细胞通透性,许多小分子标记技术都聚焦于这种经典的网状中性染料支架。在过去的几十年里,对这种现有的染料结构进行进一步的改进,生产出了先进罗丹明荧光团的商用面板,如Alexa Fluor和ATTO染料,具有更高的亮度、光稳定性和光谱范围。然而,这些荧光团被设计为用于固定细胞成像的抗体和寡核苷酸标记,而不是用于活细胞应用。因此,这些荧光团通常体积庞大,并含有极性基团(图2b),这可能妨碍它们在活细胞内的使用。我们最近发现,加入四元阿齐啶环可以显著提高经典罗丹明及其类似物的亮度和光稳定性,而不牺牲它们的小尺寸和膜通透性(图2c)。这些cell-permeableJanelia Fluor (JF)染料在活细胞内具有优异的性能,尤其适用于高级成像实验。我们继续开发具有不同光谱性质、高荧光性、可光激活和功能的衍生物在活的有机体内。*

小分子荧光团

最后的想法

荧光蛋白的易用性和持续改进使它们成为许多(如果不是大多数)荧光显微镜实验的首选。vwin德赢娱乐平台然而,当你的预算有点少的时候,小分子标记方法可以为你的成像实验提供一个新的光子注入。创新的标记策略和改进的荧光团使化学染料对细胞生物学家越来越有吸引力和可及性——我们还没有完成。对这些系统的进一步改进——更小的标签、更明亮的共轭物、更高的荧光性、光激活等——可以进一步增加光子预算,使我们能够进一步推进生物成像的前沿。

*担心你的预算?电子邮件janeliafluor@janelia.hhmi.org尝试jf染料。


确认

我要感谢布雷特·门什(Brett Mensh),一位善于言辞的幸运战士,为我提供了有用的评论。

非常感谢我们的客座博主,卢克·d·拉维斯!本博客的所有图片都是由Luke D. Lavis提供的。

路加福音Lavis头像卢克·d·拉维斯(Luke D. Lavis)目前是霍华德·休斯医学研究所Janelia研究校区的组长。他更愿意待在实验室里为先进的成像模式制造新的荧光团。在twitter上关注他@rhodamine110

参考

1.刘,哲,卢克·d·拉维斯和埃里克·贝齐格。“单分子水平的活细胞动力学和结构成像。”分子细胞58.4(2015): 644 - 659。PubMedPMID: 26000849

2.格林,乔纳森,等。一种改进活细胞和单分子显微镜荧光团的通用方法。自然方法12.3(2015):244-250。PubMedPMID:25599551。公共医学中心PMCID:PMC4344395

3.拉维斯,卢克·D,罗纳德·t·雷恩斯。“这是化学生物学的好主意。”ACS化学生物学3.3(2008): 142 - 155。PubMedPMID:18355003。公共医学中心PMCID:PMC2802578

4.薛,林,等。“通过共价标记在活细胞中成像和操纵蛋白质。”化学生物学性质11.12(2015): 917 - 923。PubMedPMID:26575238

5.克里瓦特,乔治塔和贾斯汀·w·塔拉斯卡。“用荧光标记成像细胞内的蛋白质。”生物技术的发展趋势分裂到8 - 16个。30.1 (2012):PubMedPMID: 21924508。公共医学中心PMCID: PMC3246539

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主题:vwin德赢娱乐平台,荧光成像,非蛋白荧光团

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