不要担心:双分子荧光互补使可视化蛋白质 - 蛋白质相互作用容易

由Guest Blogger.

本文由罗切斯特大学医学中心的Patrick Miller-Rhodes提供。

你可能听说过福尔斯特共鸣能源转移(FRET)。通过相邻荧光团之间的非辐射能量转移,FRET可用于检测作为蛋白质功能基础的分子间和分子内相互作用。然而,FRET实验在实践中很难实现,因为FRET依赖于许多难以实现的因素。例如,FRET要求融合蛋白非常接近,并且数量足够大(以及正确的化学计量比),从而产生可用的数据。更重要的是,测量和量化褶皱说话比做得更容易。

幸运的是,存在可视化蛋白质 - 蛋白质相互作用(PPI)的互补方法:双分子荧光互补(BIFC)。

什么是双分子荧光互补?

双分子荧光互补是一种检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法,使用分裂荧光蛋白拴在潜在的蛋白质相互作用伙伴。vwin德赢娱乐平台与FRET不同,BiFC只使用一种荧光蛋白来可视化PPIs。这个荧光蛋白(FP)被分裂成两个单独缺乏荧光的片段。当互补的FP片段融合到两个假设的蛋白质相互作用伙伴(pip)时,FP片段形成完整的FP,因为它们被连接在pip上使它们接近(图1)。完整FP的形成导致荧光显微镜可以检测到荧光信号。

BIFC示意图显示了两种蛋白质,每个蛋白质均为YFP的一部分。当两种蛋白质相互作用时,YFP的两种组分将融合在一起并发荧光。
图1:BIFC如何工作。通过两个点之间的相互作用重生分裂FP(例如,黄色荧光蛋白,YFP),导致荧光读数。

双分子荧光互补的应用

BIFC已被用于直接可视化PPIs调节多种细胞功能,包括泛吲哚脲,激酶信号传导,整联蛋白信号传导和转录因子相互作用(Kerppola,2006)。第一个二端研究员之一使用该方法询问基础亮氨酸拉链和Rel转录因子之间的相互作用的亚细胞定位(胡等人。,2002)。对于FRET,这将是更困难的,因为它需要的融合蛋白的过度表达可能导致研究的篮子的异常亚细胞定位。

BIFC的直接性质还使得更容易生成大量用于PPI的高吞吐量筛选构建体。例如,Bischof等人。(2018)在活果蝇中的450个转录因子中产生开放阅读框(ORF)库以筛选PPI。虽然已经生成了BIFC开放阅读框(ORF)库酵母(Kim等人,2019年)和果蝇(Bischof等人,2018年),在较少的转基督生物体中产生这种资源的背后。

BiFC还可以用于筛选特定PPI的小分子抑制剂。在这样的实验中,小分子抑制剂被平行测试,以防止由所测PPI产生的BiFC。这种高通量应用程序更容易执行,因为它依赖于单个BiFC对。

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如何设计BiFC实验

很像FRET,必须仔细优化BIFC实验以获得成功。BIFC实验通常涉及三个步骤:融合蛋白结构,细胞表达和量化(Kerppola,2006年,2013年)。以下将更详细地描述:

融合蛋白建设

将FP碎片融合到您的PIPS需要仔细选择FP片段,并且优选地,有关测试频率结构的一些信息。许多分裂fps已经验证为BIFC.(Kodama和Hu, 2012)。对pip可能如何相互作用有一个粗略的想法将允许您确定在何处融合FP片段。在没有这些信息的情况下,你可以将每个FP片段融合到每个PIP的N端和c端,并根据经验测试哪个组合提供了最好的荧光信号。至于连接序列,则氨基酸序列RSIAT和RPACKIPNDLKQKVMNH已成功使用(Kerpola,2006)。灵活的GS链接器也可以工作。您还需要生成负控制构造 - 更稍后的内容。有关建构融合蛋白的更多信息,请查看我们的文章:vwin德赢娱乐平台荧光蛋白101:GFP融合蛋白 - 制造正确的连接

细胞表达

是否通过转染瞬时表达BIFC构建体或稳定地影响BIFC实验的成功。在任何一种情况下,应避免过表达,因为它可以产生由于PPI独立于FP片段之间的随机关联而产生高背景荧光水平。通过比较二维菌构建体与其内源性对应物的表达水平可以通过蛋白质印迹进行过表达来评估过表达。还应将BIFC构建体的亚细胞定位与它们的内源性对应物(例如,通过免疫细胞化学)进行比较,因为这也可以通过超级性表达水平扰乱。

BIFC量化

这是BIFC超越FRET - BIFC实验只要求您的图像并测量单个FP的荧光。由于FPS之间独立于PPI之间的随机关联,您的控制构建构造可以产生适度的荧光水平。只需将BIFC构造的荧光强度与您的负面控制进行比较,以确定您的PIPS是否实际互动。

选择正确的负面控制对于BIFC实验的成功至关重要。理想的控制是一个你的一个或两个pip的变异蛋白质相互作用界面已经被破坏(Kodama和Hu, 2012)。这样的控制是必要的,因为分裂FPs可以关联,尽管是在相对较低的频率,而不会被pip带到接近。FP片段本身不能用作阴性对照,因为它们的表达水平、稳定性和亚细胞定位可能与你的BiFC结构不同,这使得解释你的结果变得困难。不幸的是,在没有结构信息的情况下,构建适当的控制可能需要通过经验测试大量突变体来识别细胞系统中抑制BiFC的突变体。

BiFC竞争分析可以用来代替负面控制(Kerppola, 2006)。在这里,一个内源性pip随着BiFC结构的增加而表达。如果你的pip实际相互作用,共同表达一个内源性pip应该以剂量依赖的方式降低BiFC信号。这在容易转染的细胞系中是简单的,质粒的剂量可以严格控制。对于慢病毒表达,这在理论上也是可能的,但可能更具挑战性。

关于如何设计BiFC实验的更多细节,详细的故障排除技巧可以在Kerppola (2006年,2013年)。

BIFC与FRET:何时选择另一个

BIFC是一种方便的荧光基方法,用于直接可视化细胞中PPI。与FRET相比,BIFC可以可视化的容易性使其在相对生理条件下研究PPI。然而,重要的是要注意,BIFC是不可逆转的 - FP片段通过彼此关联而变得共价键合 - 这意味着它不能用于测量点的解离。因此,虽然BIFC在呼叫简单的场景中是有用的,但是,否答案 - 即,两种蛋白质互动或不做?- 当PPI的时间动态是研究的焦点时,FRET是优选的。

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许多人感谢我们的客座博客帕特里克米勒 - 罗德·米勒 - 罗得罗德从罗切斯特大学医疗中心!

帕特里克Miller-Rhodes头像

帕特里克是彼得科,作家和极端运动爱好者的平等零件。他最近获得了他的博士学位。在罗切斯特大学医学中心的神经科学中,他使用了分子生物学技术来研究炎症和神经变性。每当他没有走出网格时,他现在花时间学习和写作科学。

参考

Bischof J, Duffraisse M, Furger E, Ajuria L, Giraud G, Vanderperre S, Paul R, BjörklundeLife 7。https://doi.org/10.7554/elife.38853

Hu C-D,Chinenov Y,Kerppola TK(2002)使用双分子荧光互补的生物细胞中的Bzip和Rel Compry蛋白之间的相互作用的可视化。分子细胞9:789-798。https://doi.org/10.1016/s1097 - 2765 (02) 00496 - 3

Kerppola TK(2006)分散荧光互补(BIFC)测定的设计和实现,用于活细胞的蛋白质相互作用的可视化。NAT PROTOC 1:1278-1286。https://doi.org/10.1038/nprot.2006.201

Kerppola TK(2013)双分子荧光互补(BIFC)在活细胞中蛋白质相互作用的分析。冷泉harb protoc 2013:pdb.prot076497。https://doi.org/10.1101/pdb.prot076497

Kim Y, Jung JP, Pack C-G, Huh W-K(2018)酵母蛋白异构化的全球分析。基因组Res 29:135 - 145。https://doi.org/10.1101/gr231860.117

Kodama Y,Hu C-D(2012)双分子荧光互补(BIFC):5年的更新和未来的观点。Biotech 53。https://doi.org/10.2144/000113943

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