CRISPR激活:实用指南

客人的博客

最后更新了10月7日,2020由Gabrielle Clouse。

这篇文章是由客座博主Marcelle Tuttle和Alex Chavez贡献的,他们是威斯生物工程研究所的研究人员。

CRISPR / CAS9.是一种极大的塑料工具,并通过风暴采取了科学的世界。虽然CAS9最广泛用于在DNA中创建特定编辑,但在构建CAS9转录激活剂方面也存在显着的工作。这些构建体允许通过将CAS9的突变体缺乏DNA切割活性域中的CAS9突变体来上调基本上任何基因(图1)。

Cas9激活器


使用Crispra为您的研究使用两种方法

CRISPRa用于特定的基因靶标

具有已知功能的基因的CRISPR激活具有可用于治疗剂的可能性,因为它可以增加某些基因座的基因表达,以产生表型的变化。例如,CRISPR激活已被用于分化诱导多能干细胞(Chavez等,2015)通过激活导致分化和含义的基因进入神经元细胞反向艾滋病病毒潜伏期(Bialek等,2016)。

此外,可以在环境触发器上诱导基于CRISPR的激活。这是通过创建在暴露于特定UV波长或化学物质时重新组装的分裂DCAS9蛋白来完成的(Polstein和Gersbach, 2015;Zetsche等人。,2015年)。这些类型的CRISPR激活也是可逆的:一旦环境触发叶,基因表达不再被激活。

然而,有几个因素可能会阻止您的基因上调。例如,通常,越高表达的基因是在天然条件下,使用Crispra来实现的激活越少。您感兴趣的基因可能已经击中激活的上限,即当前的CAS9系统无法帮助您传递。此外,在您知道系统按预期工作之前,激活实验通常需要相当多的调整。最后,对于您要激活的每个基因,您还应该准备好测试指向该基因的三个或四个指导,因为导向效力可能存在很大差异。

因此,在用户想要激活单个基因的情况下,我们建议使用cDNA过表达载体,而不是进行基于cas9的激活所需的所有故障排除。

基因组研究的CRISPRA

最好的用途之一CAS9激活因素是基因筛选。例如,针对人类基因组中每一个基因的gRNAs,可以使用寡聚文库合成,轻松而廉价地制造出来。在Cas9激活剂之前,类似的工具使用其他DNA结合蛋白,如锌指(ZF)和TAL效应物(TALE)。然而,与这些结构不同的是,Cas9允许你通过简单地提供一个新的gRNA,而不是工程一个全新的蛋白质,轻易地改变激活剂所瞄准的序列。这使得使用Cas9激活器更加便宜。

这种更大规模的激活也允许以探索为基础的研究。例如,CRISPRa可以通过发现激活癌细胞系中导致细胞死亡的基因来发现潜在的抗癌药物靶点(Gilbert等人,2014;Behan等人。,2019年)。由于其同时靶向多种基因基因座的能力,CrisPra也可用于映射分子途径和遗传相互作用。此外,大规模的基于CRISPR的屏幕可用于获得洞察力蛋白质结构与功能(Pan等人。,2018)。

cDNA图书馆它由过表达特定细胞类型或生物体的编码序列的质粒组成,已经以类似于Cas9激活剂的方式被使用。然而,与grna相比,这些基因很难构建和传递。此外,cdna不能用于研究在CIS.调节和也患有无法容易地携带给定基因的适当同种型,因为许多次,特定细胞类型共同的同种型是未知的或不可用的。通过从基因的本机背景激活,Cas9激活剂有效地解决了这些问题。

CAS9激活因子的优缺点和CDNA过度表达库

我应该使用哪种Cas9激活因子?

有一个各种各样的活化剂您可以使用您的实验。我们已经发现了萨姆konermann等。,2014年),Suntag.(Tanenbaum等,2014年,Gilber等,2014),冲程体积(Chavez等,2015))跨多个细胞系(HEK293T,MCF7,U2-OS,Hela,N2A,3T3)和生物(Chavez等,2016)是良好选择。要了解更多关于不同类型的Cas9激活剂,请查看我们的博客帖子覆盖VP64,Suntag,Sam和VPR。

少担心目标

与Cas9切割活性不同,脱靶效应一般不被认为是Cas9激活剂的大问题。被认为是如此的结果之前RNA-seq实验(Konermann et al ., 2014年查韦斯et al ., 2014年查韦斯et al ., 2016)以及一个相信的几率非常低,Cas9将有一个不相干的,落在另一个基因的启动子,从而推动异常转录。话虽如此,我们通常通过将基因启动子放入gRNA发现者中来选择向导,比如WU-CRISPR(Wong et al., 2015))或我们的实验室SGRNA得分手1.0(Chari et al., 2015),并选择最接近转录起始位点(TSS)的引导。我们建议在TSS上游200 bp以内的区域使用指南,但在400 bp以内的区域效果也不错。

你的实验好运!

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非常感谢我们的客座博主Marcelle Tuttle和Alex Chavez!

马塞尔图明爆头

Marcelle Tuttle是塔夫茨大学医学院的一名学生,曾是威斯生物启发工程研究所的研究员。

Alejandro Chavez爆头亚历杭德罗(Alex) Chavez是Addgene科学顾问委员会的成员。他在哥伦比亚大学的实验室专注于通过创造创新技术来推进科学发现。到目前为止,他的团队已经开发了几种流行的基于crispr的工具,用于改变DNA序列或调节基因表达。

参考

Behan FM,Iorio F,Picco G,Gonçalvese,Beaver Cm,Migliardi G,Santos R,Rao Y,Sassi F,Pinnelli M,Ansari R,Harper S,Jackson Da,McRae R,Pooley R,Wilkinson P,Van derMeer D,Dow D,Buser-Doepner C,Bertotti A,Trusolino L,Stronach EA,Saez-Rodriguez J,Yusa K,Garnett MJ(2019)使用CRISPR-CAS9屏幕的癌症治疗目标的优先级。自然568:511-516。https://doi.org/10.1038/s41586-019-1103-9

Bialek JK,Dunay Ga,Voges M,Schäferc,spohn m,stucka r,Hauber J,Lange UC(2016)使用CRISPR / CAS9衍生的转录激活系统有针对性的HIV-1延迟逆转。PLO一个11:e0158294。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0158294

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Chavez A,Tuttle M,Pruitt BW,Ewen-Campen B,Chari R,Ter-Ovanesyan D,Haque SJ,Cecchi RJ,Kowal Ejk,Buchthal J,Housden,Perrimon N,Collins JJ,Church G(2016)比较Cas9在多种物种中的激活剂。NAT方法13:563-567。https://doi.org/10.1038/nmeth.3871

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