具有改善的光敏感性的通道刺激性侵入性的光学敏感性

由Beth Kenkel.

Optogenetics是一种神经科学方法,可让您用灯开关的轻弹发射神经元。当光线闪闪发光时,神经元通常不被说服出火,但是诸如沟道流豆荚(CHRS)的光门控离子通道(CHRS)的表达使其成为光响应。当光照在兴奋性通道的神经元上表达兴奋性神经元时,通道流血脂通过打开并允许离子流入神经元,这是产生动作电位的神经元(图1)。这种光诱导的激发可以在组织培养皿中进行,但也可以在小鼠的大脑内实时发生。

但是大脑是一个棘手的机构,这通常迫使科学家使用侵入性措施来表现体内致敏实验。AAV的颅内注射通常用于向大脑提供渠道。该递送途径在大脑的一个区域中浓缩大量的频枝氨基豆,这是因为当前的通道流肌蛋白工具具有低导通孔,但也限制了渠道的血液组织(〜1mm)3.)。目前的频道曲突蛋白还需要高强度光,以便激活,这需要将光纤电缆植入大脑中。

通道的图形激活用蓝光激活。没有光线,通道流血素是无活性的,没有离子流入,神经元不会射击。凭借蓝光,通道流血素打开并允许离子的涌入神经元。这导致神经元烧制。
图1:没有蓝光,通道丛生植物保持不活跃,神经元不会射击。用蓝光,离子流入神经元并导致它发射。使用biorender.com创建。

制作基于ChannelRhodopsinOptimetics.MimeLy-Invasive,Frances Arnold的实验室和Viviana gradiinaru的实验室二手机器学习设计新的频道曲线,与当前的频道流摩历汀相比,更轻微敏感,并具有增强的电导。他们的新渠道和呼吁称为Chrgers,使大脑更容易与Optimetics进入。

工程频道的挑战

工程渠道流血脂有三种主要挑战,具有改善的光电流性质:

  1. 确定跨膜蛋白的膜表达和血浆膜定位的序列和结构,如罗摩蛋白,受到高度约束的,并且理解得差。
  2. 难以设计具有高通量蛋白质工程方法的新渠道和刺激性,如定向的进化,因为渠道流豆荚通常用低通量方法(例如贴片电池)的低通量方法评估,这是一种用于测量活细胞中离子通道的电流的技术。
  3. 通道的多种特性,例如小区定位,动力学和光谱性质,必须同时优化,以便生成成功的渠道流蛋白体内

使用机器学习来克服ChannelRhodopsin设计挑战

为了克服这些挑战,Arnold和GradInaru Labs开发了一种机器学习模型,以帮助他们用所需的特征构建“设计者”的渠道流水解植物。培训该模型以预测通道流水解素序列是否会导致功能性通道术,以及预测通道流慢患者的光电流强度,波长敏感性和外动力学。

然后使用该模型预测来自〜120,000个预测的渠道的文库的沟道流血素具有最适合于较少侵入性的光学试验的光电流性质。使用该库中的序列使用关于父母沟道的结构信息,用于产生重组沟道的肝新鼠序列。从库中的第一次删除序列预测为非功能,将库还原为1,161个序列。选择剩余的序列中的三十用于用膜片钳电体学表征表征。所有三十个是功能性的,其测量的光电流幅度,波长灵敏度和脱离动力学与模型的预测相关。

然后通过在颅内注射AAV颅内注射表达Cherger后收集的培养神经元和小鼠脑切片中的表达,进一步表现出三个顶部表演者。在两个实验中,表达锥体的神经元在低光强度的比现有的沟道流血蛋白Cochr和/或Chr 2(H134R)中产生更强的光电流。

获取缩小症,用于微创视验!

设计师频道横向与系统AAV配对,允许微创的光学机构

虽然Chrgers在组织培养皿中表现良好,但这并不能保证他们的成功体内。因此,Arnold和GradInaru实验室表达了小鼠的克林,以了解它们是否适合体内微创视源性。两种实验通过静脉注射PHP.EB,递送了克缩剂AAV衣壳能够广泛转导的神经系统这消除了对颅内注射的需求。包装在pHP.eb中,克缩剂和CHR2(H134R)两者都到达大脑,但与直接注射相比,个体神经元不会表达拷贝的CHRS副本。这种较低的感染量(MOI)使得CHR2(H134R)挑战起作用,因为它的较低的有助性需要更高的表达水平以激活神经元。然而,缩缩​​具有较高的电导率,因此它们仍然可以在较低的沼泽中去极化神经元。

通过静脉注射患者递送ChannelRhodopsin。光纤电缆允许蓝光到达鼠标脑。
图2:通过静脉注射到小鼠中递送克缩剂。光纤电缆允许蓝光到达大脑。使用biorender.com创建。

在第一个实验中,Chrger2未侵入地递送至大脑的腹侧三胺区域(VTA)中产生的神经元。由于VTA位于中脑中,纤维 - 光学套管仍然立刻植入小鼠的大脑中,使得光可以到达VTA。然后使小鼠“自刺激”它们的VTA多巴胺能神经元通过触发可激活Chrger2或Chr2(H134R)的光爆发,当它们在其笼中的孔中时。由于多巴胺是促进奖励动机行为的重要神经递质,如果渠道流血素在VTA中激活多巴胺能神经元,这应该是推动小鼠以增加他们的鼻子倾向行为。强烈的鼻子戳行为正是表达小鼠的Chrager 2所见表达小鼠的CHR2(H134R)没有这种自刺激反应。该结果表明,Chrger2更强的光电流性质使其更适合于与现有CHR2(H134R)相比用PHP.eB的全身递送。

在第二实验中,用非侵入性方法递送Chror2并用右二次电动机皮质(M2)中的神经元激活。由于M2位于大脑的表面上,以将光线传递到渠道式表达的神经元,因此该实验室可以缩小小鼠的头骨靠近M2,并将光纤套管固定到头骨上,使脑完整留下。当光纤光导通时,接收Chrger2的小鼠转向左侧,这是预期的,如果右侧M2中的神经元被激活,但接受CHR2(H134R)的小鼠没有转弯。Chrger2处理的小鼠中的左转行为停止在光线关闭时停止。

这两个实验在一起确定Chrger2在与PHP.eb的全身递送配对时改善光敏性和更高的光电流性质,这使得能够微创基因递送和致敏激发。大脑中较深的神经元的激发可能仍然需要纤维光学套管植入,但改变锥体,以便通过组织渗透近红外光来激活它们的激活将允许非侵入性的深脑视验。

TL;博士

新的频道流酷豆苷称为克林,使得在大脑中使用Optimetics更容易和更少的侵入性。


参考

Bedbrook CN,Yang Kk,Robinson Je,Mackey Ed,Gradizaru V,Arnold FH(2019)机器学习引导的通道流学工程可以实现微创的光学机构。NAT方法16:1176-1184。https://doi.org/10.1038/s41592-019-0583-8

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