这篇职位由Guest Bloggers Joachim Goedhart和Marieke Mastop来自阿姆斯特丹大学的分子细胞学和van Leeuwenhoek中心。
本系列的前两篇文章描述了选择一个实用的方法明亮的荧光蛋白A.光稳定荧光蛋白。在本系列的第三篇文章中，我们将讨论如何选择非聚集的荧光蛋白。
在水母Aequorea Victoria，AVGFP形成同态二聚体。在珊瑚中，红色荧光蛋白形成四聚体。vwin德赢娱乐平台一般来说，vwin德赢娱乐平台具有形成高阶骨料的自然亲和力和趋势。在某些应用中可以耐受该特性（例如，细胞或跟踪促进活性的标记），但在荧光蛋白用作惰性蛋白质模块的应用中存在问题。这在这里更详细地解释了这一点。有多种方法可用于测量荧光蛋白的骨料倾向。这里讨论了这些实验的基础和陷阱。
体外汇总测试
通过几种技术分析纯化的荧光蛋白以形成同偶二聚物或高vwin德赢娱乐平台阶低聚物的趋势。在非变性条件下的凝胶过滤和SDS-PAGE分离基于尺寸的蛋白质。检测到更高的分子量复合物是否取决于同源过二聚体的亲和力和蛋白质溶液的浓度。在实验期间，稀释溶液，使解释复杂化。因此，这些方法仅给出了二聚化倾向的定性视图。基于尺寸分离分子的另一种技术是超速离心的。沉淀平衡分析超速离心产生的亲和力，已经用来证明黄色荧光蛋白偶联的特征在于110μm的亲和力（Zacharias等，2002年），意味着在该浓度下50％的蛋白质形成二聚体。最后，光谱法（基于荧光极化）可用于检测同型化学。然而，所有上述方法只确定水溶液中同源化的能力。
在Cyto.汇总测试
同型蛋白质测定同源化程度，反映了荧光蛋白在细胞中相互作用或寡聚化的可能性吗？vwin德赢娱乐平台这个问题在很大程度上没有得到解答。理想情况下，荧光蛋vwin德赢娱乐平台白应充当惰性模块，该模块不能在细胞中均匀化。要了解荧光蛋白如何接近这种理想情况，已经提出了vwin德赢娱乐平台细胞测定。早期努力测试了FP-TIMULIN融合蛋白是否可以正确地形成细胞中的微管网络。其他努力测试了FP融合是否正确地定位到间隙交叉点（Shaner等，2008年）。促使促进FPS之间的相互作用干扰天然相互作用的二聚体（例如二元），防止在这些测定中进行适当的定位。然而，这些策略不会检测到弱二聚化倾向，如EGFP中存在。
Constantini等，（2012）开发了一种基于细胞的测定，可以更好地检测偶发化趋势。该测定采用衍生自细胞色素P450，Cyterm的肽，以将荧光蛋白引导到内质网（ER）中。如果发生同源化（最有可能在反平行配置中），则可见称为有组织的平滑内质网（Oser）螺纹的典型结构。这些螺纹可以为单个细胞量化，并且可以计算“正常”的细胞数。该测定将提供有关活细胞中的二聚化趋势的信息。令人惊讶的是，OSER测定揭示了TAGRFP不会作为细胞中的真正单体（Constantini，2012年），而先前是基于凝胶过滤的单体（Chudakov等，2007年）。
我们开发了各种质粒，可用于OSER测定，包括cyterm-mkokappa.那cyterm-mturquoise2.， 和cyterm-dtomato.。
在使用和解释OSER测定的结果时，您应该记住，螺纹的存在可能集中在依赖性和细胞型依赖性。因此，在开始实验之前，在您的细胞类型的感兴趣中使用所选的FP进行该测定是良好的做法。
选择非低聚蛋白质
如果其名称在“M”之前，则不能假设荧光蛋白是非二聚化，以宣称它是单体。荧光蛋白是单体的权利要求，没有随附的数据证明它是毫无价值的。Oser测定目前是测试荧光蛋白的同型化学倾向的最佳方法。几项研究使用了Oser测定以证明细胞中的单体行为（Shaner等，2013;Bindels等人，2017年）。
仍然，在纸中呈现的数据应该谨慎使用，因为研究之间的差异很大（例如，MRUBY2的性能不佳地检测到Constantini等（2015）和Bindels等人（2017）但不是Cranfill等人（2016））。此外，Oser测定中的良好性能不是一种保证，使用这种荧光蛋白标记您的蛋白质将是无问题的。
在图1中，我们提供了具有许多荧光蛋白的OSER测定的实例。vwin德赢娱乐平台对于分别建立单体和二聚酯的myturquoise2和二元的融合，用作适当的ER结构的正面和阴性对照。基于这些数据，我们得出结论，Mkok具有二聚化倾向，不适合蛋白质标记。另一方面，Mscarlet-i显示正确的ER标记，这是Mscarlet-I作为测试的细胞类型中的单体的良好证据。
要得出结论，当蛋白质标记是目标时，我们建议您尝试几个不同的荧光蛋白质（vwin德赢娱乐平台Cranfill等，2016;Constantini等，2012年）。可以将新融合的定位和生物学性能与MegFP或mturquoise2进行比较，这是建立真正的单体荧光蛋白。vwin德赢娱乐平台
结束言论
许多荧光蛋vwin德赢娱乐平台白质可用，它们的数量稳步增加。当然，您希望具有最佳性能的“最新和最伟大”的变体进行研究。但是，请注意，出版物中报道的荧光蛋白仅在有限vwin德赢娱乐平台数量的条件下表征，通常使用纯化的蛋白质。因此，必须在与之相关的条件下验证许多有前途荧光蛋白的许多关键性质（亮度，光稳定性，低聚）vwin德赢娱乐平台你的研究。
这将揭示用您将使用的显微镜在生物系统中的荧光蛋白的性能。vwin德赢娱乐平台如果您对比较的比较右侧，这将是科学界的宝贵信息。收集的知识和经验可以通过将其发布为（部分）图1，将其作为预印刷作为预印迹，或以其他方式记录它。除了数据，新质粒可以共享设计的和/或设计的细胞或生物以简化他人的比较。我们可以共同构建有价值的资源，具有指示（一组）荧光蛋白在特定条件下的性能的工具和数据。vwin德赢娱乐平台
非常感谢我们的客人博主JoachimGoedhart.和马里克米斯托克！
Joachim Goedhart是一部位于阿姆斯特丹大学的分子细胞学和van Leeuwenhoek中心的助理教授。他开发，特征，使用遗传编码的荧光探针。你可以在推特上关注他：@joachimgoedhart.。
Marieke Mastop是在分子细胞学（阿姆斯特丹大学）的博士学位候选人，在那里她开发了基于遗传编码的基于FRET的生物传感器。
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