选择B(右)est荧光蛋白:光稳定性

客人的博客

本文由阿姆斯特丹大学分子细胞学和Van Leeuwenhoek高级显微镜中心的客座博主Joachim Goedhart和Marieke Mastop贡献。

本系列的前一篇文章描述了一个选择荧光蛋白的实用方法。在本系列的第二篇文章中,我们将讨论如何选择感光稳定剂荧光蛋白

光漂白是指荧光团在光的影响下发生不可逆的破坏。任何荧光分子都会在某一时刻发光漂白。对于活细胞成像,具有光稳定性的荧光蛋白是理想的。vwin德赢娱乐平台除了光漂白,荧光蛋白可能显示可逆的强度变化(vwin德赢娱乐平台Shaner等人,2008;宾德尔斯等人,2017)和光电开关(Kremers等人,2009年),这通常是不希望的属性。在理想的情况下,荧光蛋白应该发出稳定的荧光信号,在实验过程中没有或很少显示出信号的恶化或变化。

用于活细胞成像的最vwin德赢娱乐平台佳荧光蛋白可以被多次激发,从而在被摧毁之前产生大量的发射光子。

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影响光稳定性的因素

荧光团的光漂白速率主要取决于激发功率和激发波长。当荧光团被激发出峰值波长时,它不太可能褪色,因为它吸收激发光的效率较低。同样,降低激发光的功率会减少单位时间内激发/发射周期的次数,从而降低荧光团漂白的可能性。然而,这并不是故事的全部。光漂白速率不以线性方式依赖于激发功率。这意味着将功率减少两倍并不会使光漂白减少一半。光漂白速率究竟是如何依赖于荧光蛋白的特性。这可以区别于相同光谱类别的荧光蛋白(vwin德赢娱乐平台Cranfill等人,2016)。

这种对激发功率的非线性依赖很重要,因为不同的荧光成像策略使用的激发功率大不相同(Shaner等人,2008)。在共聚焦激光扫描显微镜中,荧光蛋白被非常强烈的光激发(短时间内),而在宽视场成vwin德赢娱乐平台像中荧光团被相对较低的光激发(长时间内)。其他的照明策略,如2光子激发,选择性平面照明,TIRF或旋转盘共聚焦使用完全不同的激发功率机制。因此,它是不可预测的荧光蛋白是最光稳定的每一个条件。除了这些因素外,环境条件如细胞氧化还原状态和氧浓度也可能影响光漂白速率(Shaner等人,2008)。这给我们带来了一个关键问题:什么是比较不同荧光蛋白的光稳定性的最佳方法?vwin德赢娱乐平台

耐光性测量

耐光性mCerulean很明显,光稳定性荧光蛋白是定量活细胞成像的关键要求,因此能够定量荧光蛋白的光稳定性是很重要的。vwin德赢娱乐平台为了确定光稳定性,进行了一个实验,测量荧光强度随时间的变化。为了预测荧光团在“真实实验”中的表现,建议在现实条件下,即低激发功率下,对产生感兴趣的荧光蛋白的细胞进行延时成像。通过对不同的荧光蛋白重复这些测量,并比较荧光强度随时间的变化,可以直接比较荧光蛋白的光稳定性vwin德赢娱乐平台。

一个光稳定性测量的例子青色荧光蛋vwin德赢娱乐平台白如图1所示。值得注意的是,光漂白率不依赖于荧光强度或蛋白质分布。因此,光稳定性测量可以用可溶性荧光蛋白或定位融合蛋白进行,不需要专门的质粒或结构。vwin德赢娱乐平台

值得注意的是,文献中报道的光稳定性测量是以不同的方式进行的。我们描述了一些用于进行这些测量的实验设计的一些问题,并希望这些信息可以帮助指导您理解报告的数据。

光漂白导致荧光丧失,其最简单的形式可以用单指数衰减(类似于放射性衰减)来描述。因此,强度衰减通常用t½来描述,t½是初始荧光强度的一半保留下来的时间。第一个问题是,在某些情况下,荧光团的荧光强度衰减并不遵循简单的单指数衰减(Shaner等人,2008;宾德尔斯等人,2017)而且不能用单个参数来描述。因此,有必要了解荧光强度随时间的演变。

第二个问题是,在测量光稳定性的实验中,通常使用高激发功率来缩短实验的长度。由于光漂白率与功率不是线性相关,在大功率下得出的结论可能无法应用于实际应用中,因为实际应用中使用的功率要小得多。例如,你可能会发现你可以从你选择的FP中获得有用的数据,时间比这些大功率实验预测的要长得多。在实际功率下测量光稳定性可以更好地了解预期应用中的光稳定性(Goedhart等人,2012)

第三个问题与荧光蛋白的环境有关。光稳定性测定可以对纯化的荧光蛋白进行。vwin德赢娱乐平台为了避免扩散,这些蛋白质(i)被困在水/油乳剂中的微滴中,(ii)嵌入在凝胶中,或(iii)附着在基质上。这些在体外方法允许一个良好控制的环境,但它们不能模拟自然情况。测量活细胞的光稳定性提供了一个更现实的观点的光稳定性。

选择光稳定蛋白

光褪色的问题量化利率可以概括如下:而不是确定t½荧光蛋白的水/油乳剂在高功率,更相关的测量荧光强度的发展随着时间的推移,在活细胞力量用于live-cell成像。

综上所述,通过在显微镜系统上和拟与该荧光蛋白一起使用的细胞类型(或组织)中对相同光谱类的几种荧光蛋白进行头对头比较,可以识别出最易光稳定性的荧光蛋白。vwin德赢娱乐平台在图1中,我们提供了一个使用宽视场成像对青色荧光蛋白进行这种比较的例子。vwin德赢娱乐平台我们选择用于活细胞成像的光稳定蛋白是mTurquoise2,基于在低激励功率下获得的数据。然而,请注意,在高14倍的激发功率下,这些变体的光稳定性是可以比较的(图1的下面板)。

为了避免励磁功率的变化,在一个稳定的系统上进行一天的实验是很重要的。最后一个建议是测量你在成像实验中使用的激发功率。测量励磁功率(Grünwald等,2008)偶尔,当然是在更换了装置之后(例如更换坏掉的灯泡或交换激振滤波器之后)。这避免了激发功率的实质性变化,并将有助于控制探针的光稳定性。


非常感谢我们的客座博主JoachimGoedhart和Marieke Mastop !

约阿希姆Goedhart约阿希姆Goedhart他是阿姆斯特丹大学分子细胞学和Van Leeuwenhoek高级显微镜中心的助理教授。他开发、表征和使用基因编码的荧光探针。你可以在twitter上关注他:@joachimgoedhart

Marieke Mastop头像Marieke Mastop是分子细胞学(阿姆斯特丹大学)的博士研究生,她在那里开发基于FRET基因编码的生物传感器。

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