选择您的荧光蛋白多色成像vwin德赢娱乐平台

客人的博客

这篇文章由UCSF尼康成像中心的库尔特·索恩贡献。

活细胞成像实验的一个共同要求是能够同时跟踪多个荧光标记的物种。要做到这一点,荧光蛋白标签需要多个荧光蛋白vwin德赢娱乐平台它们的激发和发射光谱差异足以使它们在显微镜上不同的荧光通道中成像。随着近年来荧光蛋白的增殖,有许多荧光蛋白组合可以一起vwin德赢娱乐平台成像,但这也意味着荧光蛋白的选择需要一些思考。

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为你的彩色成像实验选择荧光蛋白的第一步是要知道什么荧光vwin德赢娱乐平台蛋白是可用的。随着每个月都有新的vwin德赢娱乐平台荧光蛋白发表,决定一个特定应用的最佳蛋白是一个挑战。为了让你了解最新的荧光蛋白,我有一个vwin德赢娱乐平台交互式图形和表格的最佳荧光蛋白目前可用vwin德赢娱乐平台

选择兼容的荧光蛋白vwin德赢娱乐平台

要选择一组荧光蛋白一起成像,你需要考虑vwin德赢娱乐平台与选择单个荧光蛋白相同的因素(亮度、荧光蛋白的亮度、荧光蛋白的颜色、荧光蛋白的颜色、荧光蛋白的颜色、荧光蛋白的颜色、荧光蛋白的颜色、耐光性,等等;看到之前的博文关于这些因素的更多讨论)。此外,您还需要选择荧光蛋白,可以区分彼此,并可以成像与光学显微镜(s)您打算使用。vwin德赢娱乐平台要准确测定两个荧光蛋白是否可以彼此分离,需要了解它们的激发和发射光谱,但是vwin德赢娱乐平台一个很好的经验法则是两种蛋白质的峰值激发波长和峰值发射波长都应该被50-60 nm分开。例如,CFP (ex 430nm / em 474 nm)和YFP (ex 514nm / em 527 nm)可以同时成像,但CFP和GFP (ex 488 nm / em 507 nm)显示两种荧光蛋白之间存在一些串音。vwin德赢娱乐平台如果你必须成像光谱重叠的荧光蛋白,有vwin德赢娱乐平台一些技术,比如光谱分解,可以用来分离荧光蛋白,但这些超出了本文的范围。

你的荧光蛋白和你的vwin德赢娱乐平台显微镜光学兼容吗?

要确定您感兴趣的荧光蛋白是否与显微镜光学vwin德赢娱乐平台兼容,您需要将蛋白质的激发和发射光谱与显微镜上的滤光片或激光器进行比较。理想情况下,你会希望在激发和发射滤光片和蛋白质的激发和发射光谱之间有大量重叠,这样蛋白质就能被显微镜很好地激发,蛋白质的荧光发射就能被显微镜有效地收集。为了比较荧光蛋白和滤光片之间的匹配,许多滤光片供应商提供工具来绘制蛋白质和染料及其滤光片的荧光光谱(见浓度的,Semrock的,或ω的)。虽然这些并不包含所有常用的荧光蛋白(尤其是最近发表的那些),vwin德赢娱乐平台但它们可以是一个很好的起点。在许多情况下,如果你知道你感兴趣的蛋白质有类似的光谱,那么对一个密切相关的蛋白质使用光谱就足够了。例如,这是一个来自色度光谱查看器的截图,比较标准的Cy3或罗丹明滤镜集(色度#49004)和mCherry和TagRFP的光谱。

TagRFP和mCherry的激发和发射光谱。

在这里,TagRFP光谱显示在较暗的颜色和mCherry光谱显示在较浅的颜色;激发光谱是蓝色的,发射光谱是红色的。两者都不是与滤波器集的完美匹配,但激励滤波器激发更多的TagRFP激发峰,而发射滤波器收集的TagRFP发射比mCherry发射更大的比例。对于这个滤波器集,我们期望TagRFP给出一个比mCherry更亮的信号。一般来说,为罗丹明/ Cy3设计的滤光片对较短波长的红色荧光蛋白(如TagRFP或mRuby2)效果更好,而对较长波长的蛋白质(如mCherry)效果更好。vwin德赢娱乐平台有关荧光和滤光片的背景信息,请参阅荧光显微镜简介讲座,iBiology

常用滤清器及相关荧光蛋白vwin德赢娱乐平台

用于多色成像的常用滤光片包括用于CFP、YFP和RFP的滤光片或用于DAPI /荧光素/罗丹明/ Cy5的Sedat Quad滤光片(如DAPI /荧光素/罗丹明/ Cy5)。Semrock的)和类似的4-激光组合共聚焦(405 / 488 / 561 / 640 nm)。在我们的研究中,用于成像的最佳荧光蛋白是mTvwin德赢娱乐平台agBFP2, EGFP或改良的GFP变体之一,mRuby2或TagRFP-T,以及红外荧光蛋白,如iFP1.4或iFP2.0。注意,这些红外荧光蛋白需要胆绿素作为辅助因子,所以你可vwin德赢娱乐平台能需要用胆绿素来补充你的细胞以达到最大亮度。在哺乳动物细胞中,EGFP的一种改良折叠变体,如绿宝石或三叶草,可能是最好的;mNeonGreen是一种更新的绿色荧光蛋白,被认为是非常明亮的。在酿酒酵母,我们用这个过滤器测试了一些绿色和红色的荧光蛋白,有vwin德赢娱乐平台亮度测量报告。这里,EGFP优于改进的折叠变体,可能是由于较低的生长温度。然而,这也表明,没有一种荧光蛋白适合所有生物,如果你想要发出最亮的信号,你可能需要在你感兴趣的系统中尝试几种蛋白质。最后,在这组蛋白质中,绿色和红色蛋白质通常是最易检测的,因此应该用来标记你的最不丰富的蛋白质,而蓝色和红外通道用于标记更丰富的蛋白质或标记隔间。

我希望这能对荧光蛋白的多色成像有所启发。vwin德赢娱乐平台有了正确的显微镜和正确的荧光蛋白选择,同时成像四种颜色应该是相当简单的。vwin德赢娱乐平台


感谢我们的嘉宾博主!

Kurt_Thorn-edited库尔特·索恩是加州大学旧金山分校的副教授,负责尼康成像中心。他在Ronald Vale的实验室获得了加州大学旧金山分校的生物物理学博士学位,之后他成为了哈佛大学鲍尔基因组研究中心的研究员。学习更多在他的实验室网页他的显微镜的博客


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主题:vwin德赢娱乐平台,荧光成像

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