创造果蝇位点特异性重组的新方法

由玛丽传动装置

果蝇,又名果蝇Cre-lox重组是一种非常有用的分子生物学工具,但和任何生物系统一样,它也有一些缺点。首先,Cre重组的效率因结构和细胞类型的不同而不同。第二,Cre可能诱导假或隐性loxP位点的重组(估计在哺乳动物中发生频率为1.2 / megabase),导致DNA损伤和发育异常。在多个系统中,Cre本身,没有一个floxed结构的存在,可以产生一个表型。这个问题在中国尤其突出果蝇,其中Cre从标准表示无人机/ GAL4系统对增殖细胞是有毒的。cre -雌激素受体配体结合域融合可以防止这种毒性,但需要注意的是部分重组而不是完全重组。如果你想使用特定地点的重组果蝇,继续阅读,了解适合这个系统的新的重组酶。

杰拉尔德·鲁宾的实验室试图进行复杂的基因组修改果蝇使用多个可。为了进行多次、精确的基因组编辑,所使用的重组酶必须具有高活性、低交叉反应性和低毒性的特异性。隔爆/ FRT可(从酿酒酵母)被成功地用于果蝇,因此,鲁宾试图测试另外四种酵母菌重组酶的适用性:KD(从克鲁维酵母菌属drosophilarum)、R (Zygosaccharomyces rouxii), B2(从Zygosaccharomyces bailii)和B3(来自Zygosaccharomyces孢)

生成相当于site- stop -site- myrrfp的报告基因,其中“site”代表每种酶的特定重组位点,以测试重组效率。当RFP在神经元细胞中表达时,每个细胞系都表现出广泛的重组酶依赖性RFP表达。即使在低表达水平,KD、B2和B3的重组也导致终止序列完全或接近完全的切除。而Cre的近亲Dre重组酶的切除效率仅为70%。

为了确定这些重组酶的交叉反应性,每个重组酶和报告者构建对检测切除效率。B2与R表现出部分交叉反应性;然而,其他的重组酶/报告基因对是不活跃的,即使在非常高的重组酶水平。这些数据表明,多个重组酶可以一起使用来指定特定的重组模式。

最后,Rubin的小组通过将果蝇纯合子的uas驱动重组酶与杂合子的tubulin-GAL4进行杂交,分析了这些重组酶的潜在毒性。对于Dre、Flp、KD、R、B2和B3,约50%的后代同时携带重组酶和GAL4,说明重组酶遗传正常,无毒性。而0/79的后代同时携带Cre和GAL4,进一步强调了该酶的毒性果蝇

如果你还在阅读这篇文章,而你不是在果蝇中工作,你可能会有兴趣知道鲁宾的团队发现其中两种重组酶在哺乳动物细胞中也很活跃。在实验中,B3和KD被证明在人工培养仓鼠卵巢(CHO)细胞,以及小鼠大脑2/3层的皮层神经元。

Rubin的研究表明,酵母菌重组酶KD、B2、B3和FLP可以共同应用果蝇作为特定重组的工具包需要多个重组酶的模式。这些工具将进一步增强基因组编辑能力果蝇


引用:

用于操纵动物基因组的多个新的位点特异性重组酶。Nern A, Pfeiffer BD, Svoboda K, Rubin GM。美国国家科学学会主办。2011年8月23日,108(34):14198 - 203。doi: 10.1073 / pnas.1111704108。2011年8月9日。PubMed

找到质粒@Addgene:

有关Cre使用的限制和注意事项的更多信息:

条件基因靶向的变化。施密特-苏普里安,拉杰斯基。Nat Immunol。2007年7月,8(7):665 - 8。doi: 10.1038 / ni0707 - 665。PubMed

Cre重组酶对哺乳动物细胞生长抑制及DNA损伤的研究。Loonstra A, Voojis M, Beverloo HB, Al Allak B, van Drunen E, Kanaar R, Berns A, Jonkers J。美国国家科学学会主办2001年7月31日;98(16): 9209 - 9214。doi: 10.1073 / pnas.161269798。PubMed

通过雌激素依赖的活性调节来降低Cre重组酶在增殖果蝇细胞中的毒性。Heidmann D, Lehner CF。Dev基因的另一个星球。2001年9月,211(8):458 - 65。doi: 10.1007 / s004270100167。PubMed

哺乳动物基因组中隐蔽的loxP位点:全基因组分布和BAC/PAC重组技术效率的相关性Semprini S, Troup TJ, Kotelevtseva N, King K, Davis JR, Mullins LJ, Chapman KE, Dunbar DR, Mullins JJ。核酸Res35(5): 1402 - 2007; 10。doi: 10.1093 / nar / gkl1108。2007年2月6日。PubMed


在Addgene找到cre-lox质粒。

主题:Cre-lox,果蝇,质粒

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