CRISPR 101:CAS9 Neckase设计和同源性定向修复

由玛丽传动装置

通过突变两个Cas9核酸酶结构域中的一个,研究人员创造了CRISPR nickase。Nickases产生单链而不是双链断裂,当与两个相邻的gRNAs一起使用时,可以降低脱靶编辑的可能性。在这篇文章中,我们将总结IDT(整合DNA技术)是如何首次展示CRISPR nickases是如何改进的同源性定向修复价格,并分享他们的设计规则为您的下一个CRINPR切基酶实验

Cas9镍酶概述

我们将使用SPCAS9 inckase作为此帖子的示例。D10a突变灭活Ruvc结构域,因此该酸氨基酶仅切割目标链。相反,HNH结构结构域的H840a突变产生非靶标裂解乳糜序列。而不是用WT Cas9和一个GRNA直接切割两条链,而是使用Cas9酸酐和两个GRNA产生交错的切割。

与野生型Cas9相比,Cas9镍的示意图。野生型Cas9切割了两条DNA。CAS9 D10A酸酐具有灭活的Ruvc结构域并切割靶链。CAS9 H840A酸酐具有灭活的HNH结构域并切割非靶标。

对于镍酶的应用,一个常见的问题是:grna应该如何相互比较?gRNAs必须针对不同的链来创建DSB,但这可以通过PAM-in或PAM-out取向来完成。顾名思义,PAM-out设计将PAM序列放在目标区域的极端位置,而PAM-in设计将PAM序列放在目标区域的中间位置,如下所示。

PAM-out和PAM-in GRNA设计的示意图。在PAM-OUT中,PAM站点位于目标区域的极端,对于PAM-IN,PAM网站在目标区域的中间较近。下面的原理图是针对PAM-In和Pam-Out编辑的编辑效率的图表,其显示PAM-Out设计更有效。

为了确定最优的镍酶设计,IDT科学家Mollie Schubert和Shuqi Yan设计了实验,用HEK293细胞测试镍酶的偏好。他们首先比较了不同缺口距离(40 - 130 nt)下PAM-in和PAM-out配置下D10A和H840A的总编辑效率。从这些结果可以明显看出,PAM-out配置中的编辑量要高得多。此外,D10A的编辑效率始终高于H840A,尤其是在划痕距离较小的情况下。使用D10A,他们随后发现,当gRNAs太接近(7-23 nt缺口距离)时,编辑效率很低。

D10A和H840A都是强大的编辑器,但它们的indel配置文件不同。在PAM-out配置中,D10A倾向于生成小的缺失,而H840A倾向于生成大的插入。这些配置文件可能是由于nickases生成的独特的突出模式;在PAM-out设计中,D10A创建5 '悬挑,H840A创建3 '悬挑。

探索同源性定向修复的乳酸

使用昵称的潜在好处HDR靶标范围:使用带有WT Cas9的单个gRNA,修复水平从切割点迅速减少10磅。因此,如果您无法找到靠近插入网站的良好GRNA,则无法获得高HDR效率。尼克加斯创造了一个交错的切割 - 这个系统可以在缺口之间的整个地区调解修复吗?要查明,Schubert和Yan设计了一种PAM-Out Nickase实验,以使用单链寡核苷酸(SSODN)供体插入ECORI位点。使用D10a Nickase将ECORI位点插入缺口位点之间的各种斑点,使用具有40bp同源臂的顶部或底部链SSODN供体在51个NT区域中观察> 20%的修复(最多27%)。HDR效率有利地使用WT CAS9在窗口上使用WT Cas9。在随后的实验中,它们还能够使用具有100nT同源臂的IDT MEGAMER LONG SSDNA引入更长的插入(MCHERRY)。

Cas9 D10A介导PAM远端HDR

舒伯特和阎接着研究了一种被认为是HDR次优的情况。在AAVS1.轨迹,两个最接近的GRNA具有切割位点12nt和13 nt远离目标位点而不是最佳<10nt距离。采用两种远离靶位点的GRNA部位,它们设计了D10A = Quidase策略(46 NT距离,PAM-OUT),看看它们是否可以解决这个问题。D10A尼克酶优于通过宽边缘测试的WT Cas9位点,表现出> 20%的修复效率。显然,尼氨酶策略可以扩展可靶区域,如果没有接近所需的突变位点的可用引导件,则特别有用。

图表显示CAS9 D10A在没有良好导向RNA的情况下启用HDR。总编辑是〜70%,HDR发生在〜20%的时间

nickase设计的快速提示

准备好在下次CRISPR实验中使用nickases了吗?以下是IDT的最佳建议:

  • 使用PAM-out配置
  • 优化你的间距
    • D10A:缺口网站分隔到37-68 bp
    • H840A: nick sites separated by 51-68 bp
  • HDR使用D10A
  • 将预定的插入物放置在划痕处之间

本文的文本和图片改编自IDT网络研讨会:在基因组编辑中使用Cas9 nickases的优化方法。欲了解更多信息及存档网络研讨会的链接,点击这里。我们要感谢IDT科学家Mollie Schubert和Shuqi Yan审查这篇博文。

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