这篇文章由宾夕法尼亚州立大学富布赖特访问学者库图布丁·莫拉贡献。
想象一下，您正在处理有缺陷的基因XM，其序列与正确的基因XW相同，除了单个基础。如果您听说过Crispr，可能会想到一个问题：可以努力修复缺陷的基础吗？
直到2016年，只有利用的精确单个基础变化同源定向修复(HDR)途径它在细胞中以低频率发生，依赖于供体DNA的高效传递来促进修复。自从发展以来crispr介导的碱基编辑，现在可以比以前更有效地完成这些类型的维修。底座编辑器精确地改变了单个底座，效率通常为25-75％，而通过HDR限制为0-5％的精确变化的成功。该博客文章介绍了对不同基本技术的简要评论及其对植物基因组编辑的适应性。胞嘧啶碱基编辑器
2016年，当两个独立的研究小组(Komor等人，2016和Nishida等人，2016)通过将胞嘧啶脱氨酶与Cas9 nickase (nCas9)结合，发明了crispr碱基编辑器。nCas9仅通过切断单链就在DNA上制造了一个缺口，极大地降低了有害indel形成的可能性。与DNA结合后，CBE将目标胞嘧啶(C)脱氨成尿嘧啶(U)碱基。后,合成U-G一对是由细胞修复错配修复机械制造一对原来的c g转换为一或恢复到原来的c g基地切除修复由尿嘧啶糖基化酶(图1)。尿嘧啶糖基化酶抑制剂的存在(UGI)最小化第二个结果,增加的生成期望的T-A碱基对。
腺嘌呤基础编辑（ABE）
如果你有另一个基因Y，它有一个缺陷等位基因Ym，你需要将腺嘌呤(a)转化为鸟嘌呤(G)，会怎样?您可能想知道CRISPR-base编辑器能否执行此更改。然而，没有自然已知的“DNA腺苷脱氨酶”理论上可以产生腺嘌呤碱基编辑器。
巨大的蛋白质工程努力Gaudelli et al。结果成功进化出一种腺苷脱氨酶，可以作用于DNA进行腺嘌呤碱基编辑。他们首先创造了一个有缺陷的氯霉素抗性基因(CamR)，通过引入点突变(H193Y)。通过腺嘌呤碱基编辑器逆转这种突变将恢复抗生素耐药性。为了找到这种蛋白质，他们创造了一个突变文库大肠杆菌tRNA腺苷脱氨酶(ecTadA)将其与dCas9融合，转化成大肠杆菌藏着有缺陷的CamR基因。筛查幸存的殖民地和随后的进化和工程的筛选引发了一个突变的TADA（TADA *），令人满意地接受DNA作为其基质（见图2）。
人工进化的腺苷脱氨酶催化一个目标' a '到' I '(肌苷)，它被细胞聚合酶视为' G '。随后，原基因组的a - t碱基对转化为G-C碱基对(图1)。由于细胞肌苷切除修复不如尿嘧啶切除活跃，ABE不需要CBE中任何额外的抑制蛋白，如UGI。
植物基因组的碱基编辑器
这些初步研究表明，在哺乳动物中碱基编辑是成功的，但在植物系统中缺乏碱基编辑器。因此,杨实验室宾夕法尼亚州立大学(PSU)正在为植物系统调整和改进碱基编辑平台。
植物腺嘌呤基础编辑器
我们开发了植物腺嘌呤碱基编辑器(ABE)载体，用于在植物基因组中安装A >g或T>C突变体。我们构建了三个版本的载体(pKABE6.3、pKABE7.9和pKABE7.10)，以便用户可以根据“A”相对于原间隔子邻近基序(PAM)的位置优化碱基编辑效率。如果目标A位于一个小的基因组窗口:在原间隔区位置4-8，将“NGG”PAM计算为21-23(图3)。如果目标A更接近PAM，即位于原间隔区8-10，那么ABE6.3或ABE7.9更适合(高德利等人，2017年)。我们的向量有两个Bsa1位点克隆在POL-III（OSU3）启动子驱动表达系统中的单引导RNA（Protospacer +支架）。我们使用单一多顺反子tRNA-gRNA (PTG)基因系统克隆多个原间隔子，使我们能够同时瞄准多个基因组位点。
这些二元载体可用于通过稳定的基因组编辑植物通过农杆菌介导的转化。我们还构造了使用原生质体制转换的瞬态测定的较小载体。
植物胞嘧啶碱基编辑器
有几种cbe可用于植物系统。基于救援对象(CBE-2)- - -基于rAPOBEC (CBE-1)- cbe是水稻、番茄、小麦和马铃薯的成功碱基编辑器。已知，基于靶标- aid和rAPOBEC的cbe可以分别将胞嘧啶脱氨基于原间隔子的2-6 bp和4-8 bp处。
如果目标胞嘧啶更接近PAM网站？CBE使用HAPOBEC3 Deaminase开发可以在相对于PAM序列的拉伸窗口中编辑，范围为1-17bp（Zong等人，2018)(参见图3中的CBE-3)。
植物CBE和ABE扩展了PAM兼容性
上述所有基础编辑器是SPCAS9基于酸氨酸酶，并且取决于距待编辑碱（C / A）的合适距离的“ngg”Pam的存在。但这是否意味着目标C或进一步从'ngg'pam无法编辑？他们可以，但他们需要其他基础编辑器平台。华等。构建了许多植物碱基编辑器，用SpCas9和SaCas9的突变版本替换SpCas9，这些突变版本识别PAM序列而不是NGG(表1)。
| 类型 | Nickase Cas9（D10A） | 脱氨酶 | PAM需求 | 参考 |
| CBE | SPCAS9. | rAPOBEC1 | NGG | 6 |
| SPCAS9. | 救援对象(PmCDA1) | NGG | 5 | |
| SpCas9-VQR | rAPOBEC1 | NGA | 8 | |
| SaCas9-KKH | rAPOBEC1 | nnnrrt. | 8 | |
| 安倍 | SPCAS9. | 这样* | NGG | 9 - 12 |
| SpCas9-VQR | 这样* | NGA | 8 | |
| SaCas9 | 这样* | NNGRRT | 9 | |
| SaCas9-KKH | 这样* | nnnrrt. | 8 | |
| SpCas9-VRER | 这样* | NGCG | 8 |
设计植物碱基编辑实验的提示
- 根据ProtoSpacer序列的目标基础的位置，选择基本编辑平台。
- 如果您没有在目标基因组轨迹/基因座中找到合适的“NGG”PAM，请根据PAM序列选择从表1中的基本编辑器变体。
- 避免将“G”碱基后面的“C”作为目标，因为CBE在“GC”序列上下文中是低效的。如果无法避免，请选择目标AID版本。
- 一些基因组位点的碱基编辑效率很低，甚至为零。由于核小体或其他蛋白质的存在，一些位点可能是碱基编辑器无法访问的。
- 您可以在瞬态测定中的转换后48-72小时检测到基础编辑。为了稳定转化，可以对再生植物进行基因分型。如果成功的基础编辑会导致创造或破坏任何限制酶（重新）识别现场，重新分析PCR扩增产物的检测结果均可用于检测成功。尽管使用base编辑器生成indel的机会很小，但请记住，indel的生成有时也会导致RE站点的销毁。
非常感谢我们的客座博主来自宾夕法尼亚州立大学的Kutubuddin Molla
Kutubuddin Molla是全国水稻研究所，Cuttack，Odisha，Indish的Ag-生物技术学家。目前Kutubuddin是宾夕法尼亚州立大学，美国大学公园的富布赖特访问学者。Molla博士对大米的精确基因组编辑感兴趣，并使用基础编辑和HDR方法在PSU的银阳实验室中进行稻米作物。
参考文献
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3.Gaudelli, Nicole M.等。"基因组DNA中A·T到G·C的可编程碱基编辑不需要DNA裂解"自然551.7681(2017): 464。PubMedPMID:29160308。公共医学中心PMCID:PMC5726555。
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12.Molla，K.，Shih，J.＆Yang，Y.多重Crispr-介导的稻米介导。在基因组工程中：CRISPR-CAS革命，冷泉港实验室（2018）。
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