CRISPR 101:哺乳动物表达系统和递送方法

在妮可Waxmonsky

最后更新于2020年9月30日,作者:Marcy Patrick。

基因组编辑目的已广泛采用CRISPR技术,因为它比先前编辑技术更便宜,更快,更容易。每月都会发布越来越多的CISPR工具,使CRISPR成为您的下一次实验的绝佳选择!

在这篇博文中,我们将提供一些CRISPR哺乳动物表达系统的概述,每种系统的典型应用,以及潜在的传递方法。

CRISPR-CAS9的关键组分:CAS9内切核酸酶,GRNA,PAM和靶序列。CRISPR应用:基因组工程,转录规则和其他应用。

计划你的CRISPR实验的一般考虑

与任何实验一样,在规划过程中需要考虑许多因素。对于CRISPR实验,以下框架可以帮助您开始:

  1. 确定您尝试实现的结果类型:您是否希望永久敲门或敲入基因?你想要_____吗激活基因表达?您是否尝试创建单点突变?你想要_____吗用报告蛋白创造融合如GFP?所有这些结果都可以通过不同的CRISPR组件最有效地实现。
  2. 为您的应用选择适当的CRISPR工具:WildType Cas9或Cas9 nickase是否适合产生敲除或敲入,或引入突变标签虽然催化死DCAS9可以与活化剂或阻遏域结合使用以控制基因表达。基础编辑器可以帮助您在GRNA靶位点附近进行精确点突变。
  3. 选择合适的表达式系统和交付方法:您是否需要稳定的集成或瞬态表达式?您将编辑哪种细胞类型?您是否希望将组件作为DNA传递,或者mRNA或蛋白质递送更合适?
  4. 确定你的意志评估结果你会使用错配修复检测来检测插入/删除吗?或者聚合酶链反应之后是凝胶电泳和/或新一代测序更合适?
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如果你已经有了一个最终产品,那么步骤1和步骤2通常会很简单。步骤4也一样,因为这直接与你的具体目标有关。然而,当考虑到第三步时,你可能会惊讶于可用选项的数量——你如何在它们之间进行选择?

第一步是确定你需要交付的CRISPR组件。任何应用程序至少需要一个或多个sgRNAs和Cas9。如果你想包含同源定向修复(HDR)如果你想要创建敲入,点突变,或者添加标签,你还需要传递一个供体质粒或单链DNA寡核苷酸,所以你需要确保你的表达系统和传递方法与你的所有组件兼容。

接下来,考虑基于模型系统的CISPR组件的最佳表单。CRISPR试剂可以通过转染,核原味,病毒转导或注射作为蛋白质,RNA或DNA来递送。最后,一旦确定了最佳表达式系统,就可以选择将那些CRISPR组件引入目标单元格中​​的最佳方法。

哺乳动物CRISPR表达系统

每个模型系统都有其拥有的最佳实践,以便高效地提供CRISPR组件。如果您是CRISPR或Model系统的新手,良好的第一步将是咨询文献,看看是否有人发布了一个适用于您的系统的协议。addgene有存款人提交的协议并链接到aCrispr论坛在那里你可以找到关于你选择的系统的信息。下表总结了每个表达系统包含的各种组件以及适当的应用程序。

表达系统 组件的系统 应用程序
哺乳动物表达载体 推动者驾驶CAS9表达可以是构成型或诱导的。U6启动子通常用于GRNA。可以含有报告基因(例如GFP)以鉴定和富集阳性细胞或选择标记以产生稳定的细胞系。 Cas9和/或gRNA在哺乳动物细胞系中短暂或稳定表达,可以高效转染。
慢病毒转账 Cas9和gRNA可以存在于单个或单独的慢病毒转移载体中。可能含有报告基因(如GFP)来鉴定和富集阳性细胞。可能包含一个选择标记产生稳定的细胞系。包装和包膜质粒提供必要的组分制作慢病毒颗粒。 在各种哺乳动物细胞系中稳定,可调谐的Cas9和/或GRNA表达。可用于难以转染细胞类型并且可以使用体内。进行常见的开展选择基因组屏幕使用CRISPR
AAV转账 只兼容SaCas9(包装限制~ 4.5 kb)。CRISPR元件被插入到AAV转移载体中,用于生成AAV粒子。 Saca9和/或GRNA的瞬时或稳定表达。感染分裂和非分裂细胞。AAV是最不毒性的方法体内病毒递送。
Cas9 mRNA和gRNA 含有gRNA和Cas9的质粒用于体外转录反应产生成熟CAS9 mRNA和GRNA。使用显微注射或电穿孔将RNA递送至靶细胞。 当RNA降解细胞内时,表达的瞬时表达减少,表达降低。可用于产生转基因胚胎。
Cas9-gRNA核糖核蛋白复合物 纯化Cas9蛋白和体外转录的GRNA组合形成Cas9-GrNA复合物和交付使用阳离子脂质的细胞。 CRISPR组分的瞬时表达,随着gRNA和Cas9蛋白在细胞内的降解,表达量下降。

哺乳动物细胞系的递送方法

如上所述,您在许多方面选择的表达式系统决定了将那些CRISPR组件引入目标单元格中​​的最佳方法。将这些组件递送到哺乳动物细胞系中是相当宽泛的,包括几种不同的方法,因此我们已经总结了以下通用交付方法的一些关键功能:

化学转染

脂质介导 阳离子聚合物 磷酸钙
细胞 转化细胞系 转化细胞系 转化细胞系
货物 核酸或蛋白质 核酸 核酸
吞吐量
效率 中等的 中等的 中等的
困难 简单的 简单的 简单的

物理转染

电穿孔/ Nucleofection 显微镜下注射
细胞 许多类型 单细胞
货物 核酸或蛋白质 核酸或蛋白质
吞吐量 非常低
效率 非常高的
困难 非常容易 很难

病毒递送

慢病毒 逆转录病毒 AAV.
细胞 分裂或: 分裂 分裂或:
货物 核酸 核酸 核酸
吞吐量
效率 变量 变量 变量
困难

这些表格并不包括所有的方法,也不局限于体外细胞培养。用户应该回顾当前文献关于他们喜欢的模型。

如果你的表达系统在CRISPR使用方面没有很好的特征,你会想要投资一些时间来优化和测试CRISPR传递的效率。Addgene有一些质粒已经作为CRISPR测试工具发表:

交通灯报告系统:可以评估慢病毒组分交付以及基因组修复非同源端连接或HDR。

EGFP验证SGRNA:可以通过在基因组靶序列中克隆到EGFP记者中来评估组分递送和SGRNA疗效。

目标DNA报告系统:能够使用验证过的工具评估组件交付。


特别感谢Joel McDade创建表达式系统表。Marcy Patrick致力于写这篇文章。

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