CRISPR 101:GRNA的多重表达

由玛丽传动装置

玛丽传动

最初发布2016年1月28日,最后更新了詹妮弗·曾任2020年9月10日。德赢在线

Carprpr易于瞄准多个基因座 - 一个叫做概念多路复用.由于CRISPR是如此强大的系统,因此在一个质粒上添加多个GRNA时,编辑或标记效率通常不会改变。听起来不错?Addgene有许多工具可以帮助您多重复用 - 我们将使用哺乳动物质粒向您介绍一些潜在的选择和克隆方法,但请向下滚动适用于其他模型系统的质粒,包括大肠杆菌, 植物,果蝇,斑马鱼!

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为什么要使用多路复用的GRNA?

通过在同一质粒上表达多个GRNA,您将确保获得质粒的每个细胞含有所有所需的GRNA。这增加了所需的所有编辑都会发生的可能性。

多重gRNAs存在的原因有很多,其中一些是:

  • 使用双nickases生成淘汰赛或编辑。这有助于减少偏离目标的活动。
  • 通过去除两个靶位点之间的序列来删除基因组的一个大区域。
  • 立即改变多种基因。使用多路复用GRNA可以针对基因组中的多个位置进行修改,无论是编辑CRISPRI,CRISPRA还是基本编辑。

多路复用GRNA:基础知识

一个常见的问题Addgene高级科学家接受是:我可以使用像这样的质粒表达来自单个启动子的多个GRNAPX330?不幸的是,简短的答案是否定的。除非你使用一个系统来处理一个连续的多gRNA转录本,否则每个gRNA必须从它自己的启动子中表达。但这并不意味着你必须克隆和转染多个启动子- grna来靶向多个位点!在本文中,我们将介绍Cas9多路复用选项,但也可以查看我们关于Cpf1多路复用的博文。


多重GRNA表示为单个构建体表示的几种GRNA

让我们从最简单的多路复用情况开始:您只需同时表达两个GRNA。您可以使用的一个系统是px333文图拉实验室.PX333,PX330的修饰,含有人源化的WTCAS9和两种U6启动子。为了使用这种质粒,您只需为您所选择的GRNA靶序列达到寡核苷酸,就像你一样克隆它们。您将使用限制酶Bsai使用限制酶BBSI和第二GRNA在第一GRNA中克隆。如果你在工作果蝇双grna表达质粒可从中获取Bullock Lab.可以使用Gibson组装或SLIC克隆方法插入GRNA。基于BSAI的大肠杆菌多路复用质粒可从中获取Koffas实验室


用金门和吉布森组装方法放大多重gRNAs

如果您想扩展质粒中GRNA的数量,您需要使用一些装配方法,例如Golden Gate或Gibson组装。

Grnas的金门组件

金门组装使用IIS型限制性内切酶,在其识别序列之外分裂,创造侧翼悬垂。可以对这些外延进行定制,以将多个片段链接在一起,从而允许将多个组件有序地组装成目标向量。

CRISPR / CAS9金门复用的第一步是克隆使用酶BBSI将每个GRNA靶序列指定的寡核苷酸克隆到不同的表达载体中。这些表达载体各自含有促进剂-GRNA构建体的型IIS限制性位点,但是邻近位点的不同序列。当用适当的IIS酶消化时,独特的侧翼突出序列可以链接在一起,以允许有序组装到表达CAS9的目的地向量中。这在下面的示意图中示出。

使用寡核苷酸克隆每个GRNA靶序列。然后将这些单独的GRNA组装在一起进入目的地向量。

使用寡核苷酸将GRNA靶序列(有色矩形)克隆到各种质粒中。这些质粒含有侧翼所述启动器-GRNA构建体的IIS限制性位点。当这些质粒被消化,与切割位点相邻的独特的悬垂(这里,O1-4)一起将有序的组件驱动成含Cas9的目的地向量。注意:根据您使用的方法,程序将略有不同。

addgene提供的两种金色门选项遵循这些相同的装配原理,但它们以不同的目的优化。

Gersbach实验室多路复用质粒:

质粒组允许您表达2-4 GRNA,四个是理想的数字。首先,产生四种独特的卡霉素抗性质粒,每种抗性质粒,每种抗性质粒均在7SK,人U6,小鼠U6或人H1启动子下游含有不同的GRNA靶序列。如果您表达少于四个GRNA,您将在每个未使用的启动子中克隆到多终止序列中。该步骤是必要的,以产生最终连接步骤所需的所有突出突出。然后使用BSMBI消化质粒并将其连接到CAS9或含DCAS9的目的地媒介中。目标向量选项包括人性化WT Cas9,dCas9(转录抑制因子), 和DCAS9-VP64(转录激活器)- 筛查质粒。每个目标向量包含GFP,使您能够选择具有高GFP表达式的单元格。这些细胞具有最高水平的CAS9和GRNA表达,因此是基因组编辑事件的最高频率。

山本实验室多重CRISPR/Cas9组装套件:

此套件是为严格的复用而构建的,使用户可以表达最多7个GRNA。套件包含不同的目的地向量,具体取决于您希望克隆的GRNA总数从2-7。例如,如果您表达了4个GRNA,则会使用PX330A-1X4;对于6个GRNA,您可以使用PX330A-1X6.此定制意味着您不需要在填充序列中克隆。要构建您的复用构建体,您将所有的GRNA克隆到抗透明霉素的质粒中pX330S-2至pX330S-(最后gRNA号).将5'大多数GRNA克隆到含Cas9的目的地载体中。使用Bsai消化这些构建体并组装以产生编码GRNA和Cas9的质粒。与Gersbach实验室质粒一样,可以使用多种CAS9变体:WT人性化Cas9,D10A尼斯突变体(Cas9n),dcas9(转录镇压),和Fok1-DCAS9.(二聚体核酸酶)。

网关装配方法

免费实验室多重慢病毒表达系统(MuLE)试剂盒:

该试剂盒可用于创建表达WT人性化Cas9和最多三个GRNA的慢病毒载体。vwin668含有套件的含有U6启动子和GRNA支架的入口载体。指定GRNA种子序列的寡核苷酸应与IIS型BFUAI型相容。网关克隆然后用于将多个GRNA和CAS9结合在一起中成单个质粒。尽管只有WT HCAS9条目向量提供了套件,但您可以克隆您自己的入门向量,其中包含其他CAS9变体用于与Mule系统一起使用。

从单个转录物中复用

您还可以通过多函数转换GRNA。GRNA而不是从不同的启动子转录,并且通过允许它们被切割和释放的特异性位点侧翼。这些构建体倾向于小于具有多个启动器-GRNA盒的构建体,使它们有利于像AAV这样的小容量向量。除了下面描述的哺乳动物选择外,还可以从中获得制备多级GRNA的质粒杨实验室用于植物。

哺乳动物多重系统使用CSY4 RNA核酸酶铜绿假单胞菌.当过度表达时,CSY4有效地切割GRNA夹在28个基础CSY4识别位点之间。如果没有表达CSY4,则无法释放GRNA,向系统添加时间和/或空间控制。pSQT1313来自joung实验室允许您表达使用寡核苷酸组件构建的两种GRNA。与上述一些质粒不同,该载体不含CAS9,因此您需要用另一种质粒提供。

多种gRNA表达策略的比较。标准的Pol III gRNA盒对多路复用有很大的尺寸限制。Csy4可切割的盒较小,需要Csy4核酸酶的共表达。PTG盒有强大的gRNA表达,被内源性核酸酶裂解。
多路复用策略的比较,包括标准的PolIII-gRNA盒、Csy4-cleavable盒和PTG盒

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植物中多路复用

金门/吉布森组装多路复用质粒:

拟南芥照片这些质粒允许你通过金门或吉布森组装2-4个gRNAs。使用BsaI将grna插入pCBC载体,PCR扩增启动子- grna片段,克隆到三种载体中的一种Zeamays.密码子优化的Cas9的二进制矢量。该系统与单子叶床和Dicot植物兼容。

刘实验金门/吉布森装配多路复用质粒

这些质粒在金门或吉布森组装后可表达多达8个gRNAs。利用BsaI将gRNAs克隆到12个包含多种启动子和报告子的pYLsGRNA质粒中的一个,然后插入到基于pCAMBIA的含cas9的目的载体中。Cas9是植物优化的,质粒可用于单子叶和双子叶植物,可以选择潮霉素或Basta。

阳实验室单人转录多路复用质粒

这些质粒与上面描述的Csy4多顺反子系统相似,除了它们使用内源性核酸酶系统来切割gRNAs。gRNAs的两侧是甘氨酸tRNAs,以产生多顺反子甘氨酸tRNA-gRNA (PTG)结构。真核RNases P和Z可以识别tRNA序列,并将其裂解,释放gRNAs。PTGs通过Golden Gate组装组装成含有cas9的wt载体,可以同时表达多达8个gRNAs。用于瞬时表达和农杆菌介导转化的载体已经获得。有关此系统的更多信息,请查看这个博客帖子

在斑马鱼中复用

斑马鱼的照片温彪陈立实验室集装多重质粒

这些质粒允许在斑马鱼中表达2-5个GRNA。根据您希望克隆的GRNA总数使用自定义目标向量,因此您不必克隆任何填充序列。您还可以选择包括先前设计的TyR GRNA,从而导致过度降低,从而标记具有内部修饰的细胞。在该系统中,CAS9必须在单独的质粒上提供。

在果蝇中复用

果蝇照片Bullock Lab Multiplex质粒:

可以使用Gibson组装或斜线克隆组装两个GRNA。GRNA从两种果蝇U6启动子表达。CAS9必须在单独的质粒上提供。

复用in.大肠杆菌

ecoli映像Koffas Lab Cislpatlbrick多重质粒

该系统允许您组装II型用于基于DCAS9的转录抑制的CRISPR阵列。Ciscathbrick质粒含有两个粘性的间隔物,两个粘度均重复。可以使用BSAI消化垫片,允许插入间隔重复的“砖”。BSAI网站保持完整,允许随后的“砖”逐一添加。这种方法特别适用于组合分析。For example, if you were to develop an array using 3 distinct spacer-repeats, you could easily create 7 unique arrays (e.g. for spacers A, B, and C, you could obtain arrays A, B, C, AB, AC, BC, and ABC).

尼尔森实验室大肠杆菌Crmage质粒:

CRMAGE系统是一种快速,复杂的方法,可以结合CRISPR和基于重组的法验(多路复用自动化基因组工程)技术。PMA7CR_2.0.表达分别由l -阿拉伯糖和无水四环素(anhydro四环素,aTet)诱导的lambda Red和Cas9。PMAZ-SK.含有ATET-IMICIBLE GRNA和骨架靶向GRNA盒,用于通过L-rhamnose和ATET诱导后通过“自破坏”来固化质粒固化。CRMAGE比传统的重组更有效,点突变效率为96-99%,小插入的效率为66%。效率> 70%同时可以同时复用两个目标。CRMAGE是一种令人难以置信的快速协议,单一轮编辑只需要5小时的孵育时间,以及随后的固化方案,只需要2-3小时孵育。

Kondo实验室多路复用基本编辑E科利

Kondo实验室用Cas9表达了一种胞嘧啶脱氨酶融合,用尿嘧啶DNA糖基酶抑制剂,具有降解标签(LVA标签),以实现特定的点突变E科利.gRNAs在不同的质粒上传递,可以同时对6个不同的基因进行多重编辑。该系统不依赖于任何附加的或宿主依赖的因素,可以用于广泛的细菌。


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参考

1.马达洛,达尼洛等人。”体内利用CRISPR/Cas9系统进行致癌染色体重排工程。”自然杂志516(7531)(2014):423-7。PubMedPMID:25337876.公共医学中心PMCID:PMC4270925

2. Kabadi,Ami M.等人。“从单一慢病毒载体的基于多路复用CRISPR / CAS9基因组工程。”核酸研究42(19)(2014):E147。PubMedPMID: 25122746.公共医学中心PMCID: PMC4231726

3. Sakuma,Tetsushi等。“使用一体式CRISPR / CAS9向量系统”人类细胞中的多重基因组工程。“科学报告4(2014年):5400. PUBMEDPMID:24954249..公共医学中心PMCID:PMC4066266.

艾尔伯斯,joachim等。“用于快速组合哺乳动物遗传学的多功能模块化矢量系统。”临床调查杂志125(4)(2015):1603-19。PubMedPMID:25751063.公共医学中心PMCID:PMC4396471

5. Tsai,Shengdar Q.等人。“二聚体CRISPR RNA引导Foki核酸核酸余量,用于高度特异性的基因组编辑。”自然生物技术32(6)(2014):569-576。PubMedPMID: 24770325.公共医学中心PMCID: PMC4090141

6.“一种用于植物多基因组编辑的CRISPR/Cas9工具包。”中国科学院植物生物学研究所,2014。PubMedPMID: 25432517.公共医学中心PMCID:PMC4262988.

7.马,兴良,等。“一种强大的CRISPR / CAS9系统,即在单子叶植物和单子植物中的方便,高效多重基因组编辑。”分子植物8(8)(2015):1274-1284。PubMedPMID:25917172

8.谢,卡宾,苗圃,巴斯蒂安,云阳。“通过内源性TRNA加工系统提高CRISPR / CAS9多路复用的编辑能力。”美国国家科学院的载体美国112(11)(2015):3570-5。PubMedPMID:25733849..公共医学中心PMCID: PMC4371917

9.“利用Cas9和sgRNAs的转基因表达进行多重条件诱变”遗传学200(2)(2015):431-441。PubMedPMID: 25855067

10.端口,Fillip等。“优化的CRISPR / CAS工具,用于高效种系和果蝇中的体细胞基因组工程。”美国国家科学院院士USA 111(29)(2014):E2967-2976。PubMedPMID:25002478.公共医学中心PMCID:PMC4115528

11. Cress,Brady F.等人。“Cisspathbrick:II型-A型CIRSPRAS阵列的模块化组合组装为大肠杆菌中的DCAS9介导的多重转录镇压。”ACS合成生物学4(9)(2015):987-1000。PubMedPMID:25822415

12.Ronda, Carlotta等人(2016)。CRMAGE: CRISPR优化的MAGE重组。SCI代表。6:19452。PubMedPMID: 26797514

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