CRISPR 101:非同源最终加入

由Guest Blogger.

上次更新9020年9月1日。

这篇帖子由大卫威特和戴尔·拉姆斯登(Unb在Chapel Hill)的贡献。

使用CRISPR / CAS系统进行基因组工程的一个优点是CAS9可以容易地编程以在用户选择的情况下在基因组中进行DNA双链断裂(DSB)。在初始切割之后,过程中的下一步涉及修复染色体DSBS.。重要的是要知道细胞具有两个主要的修复途径-非同源终端连接(NHEJ)和同源性定向修复(HDR)- 以及这些途径如何工作,因为规划实验时可能是相关的。在这里,我们将讨论NHEJ,以及它如何影响基因组中Cas9介导的DSB会发生什么。

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非同源最终连接步骤

与HDR不同,NHEJ在整个细胞周期中活跃,并且具有更高的维修能力,因为没有要求修复模板(姐妹染色体或同源物)或广泛的DNA合成。NHEJ还完成了几十分钟内大多数休息的修复-速度比HDR快。因此,NHEJ是根据修复CRISPR / CAS9引入的断裂的原理意味着。

NHEJ维修需要以下因素,无论最终结构如何,并决定途径的主要事件:

  1. 破损的结束被加载所识别KU70 / KU80异二聚体
  2. KU随后用作脚手架,用于募集激酶(DNA-PKCS)和两个亚基DNA连接酶(XRCC4-LIG酶IV);一起与一些配件因素(Paxx,XLF.),该复合物将一对DNA末端保持在一起,形成配对的末端复合物
  3. 然后将成对的末端复合物连接到兼容的DNA结束,从而修复断裂。

这是该途径的简化,流线型版本,并且不考虑对DSB的生物学来源共同的缺失或受损的核苷酸,并且需要处理。在连接之前进行处理,因为不相容的DNA结束干扰该步骤。因此,NHEJ具有巨大的处理因子工具箱,包括聚合酶(POLμ和POLλ),核酸酶(Astemis)和结构特异性的最终清洁酶(Aprataxin,TDP2),其能够使结束更好的基材用于连接。虽然我们这里没有描述这些步骤,但DNA结束的处理趋于是引入突变的点。

通过NHEJ修复Cas9诱导的休息

如下所示,NHEJ介导的CAS9生成的断裂修复如果意图是在感兴趣的基因中敲门出来,则非常有用,因为它容易产生诱导误差。NHEJ维修过程中产生的indel错误通常很小(1-10bp)但非常异质。因此,大约有三分之二的机会导致颤音突变。在一些重要性中,当通过侧翼序列(“微泡沫学”)的序列同一性约束时,缺失可以不均匀。

非同源终端连接

NHEJ没有义务介绍indels。鉴于Cas9 DSB的结束结构(没有核苷酸损伤的钝性或近钝端)这种产品很少见,可能占修复事件的不到5%。然而,在诱导产品的情况下,精确修复的产品容易重新切割,因此重复的循环将有利于后一种产品的积累。如上所述,单一的切割和精确修复的循环应少于一个小时,因此组成型表达目标CAS9的细胞群应在一天内大多数染色体中具有诱导。预期对修复的另一个因素是Cas9蛋白在切割后不会立即从断裂端释放,这可能会干扰Ku和正常的NHEJ活性。其他因素也可以影响NHEJ活动。例如,压制RECA和过度表达NHEJ机械改善了NHEJ准确性mSmegmatis.(Yan等人,2020)。

NHEJ也可以通过规范CAS9方法的变体来参与。一对CRICPR导向器,侧翼区域数百碱基对或更高可以同时引入一对染色体断裂,并且如果NHEJ连接在一起,则可能导致缺失干预DNA(“弹出”缺失)。类似地,通过NHEJ依赖性修复(“弹出式”插入)直接将外源性DNA片段直接插入Cas9靶向断裂(或一对突破)。提供含有兼容突出的模板。CAS9也可以改变以产生目标单链断裂;当两个这样的断裂彼此接近时,在相对的股线中。这种“双缩乳”策略大大减少了偏移地点的突破和突变。

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Christina Mork贡献了这篇文章的更新。

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David Wyatt是一个对决定破损的结构如何影响它们的修复方式感兴趣的研究生。他在戴尔的实验室工作。

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戴尔·拉姆斯登是遗传学和分子生物学课程的成员,生物化学和生物物理学部和UNC教堂山的Lineberger综合癌症中心。

参考

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BétermierM,Bertrand P,Lopez BS(2014)是非同源终端加入真正的错误易于易受的过程吗?Plos Genet 10:E1004086。https://doi.org/10.1371/journal.pgen1004086

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Waters Ca,Stande Nt,Pryor JM,Strom CN,Mieczkowski P,Burkhalter MD,OH S,QAQUSH BF,Moore DT,Hendrickson EA,Ramsden Da(2014)连接步骤的保真度决定了在非致译期结束期间的结局如何解决。NAT Commun 5:。https://doi.org/10.1038/ncomms5286

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