CRISPR 101:非同源端连接

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上次更新9020年9月1日。

这篇帖子由大卫威特和戴尔·拉姆斯登(Unb在Chapel Hill)的贡献。

在基因组工程中使用CRISPR/Cas系统的一个优点是,Cas9可以很容易地被编程,在用户选择的任何地方制造基因组中的DNA双链断裂(DSB)。在最初的切割之后,接下来的步骤包括修复染色体双边带.重要的是要知道细胞具有两个主要的修复途径-非同源终端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)- 以及这些途径如何工作,因为规划实验时可能是相关的。在这里,我们将讨论NHEJ,以及它如何影响基因组中Cas9介导的DSB会发生什么。

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非同源端连接步骤

与HDR不同,NHEJ在整个细胞周期中活跃,并且具有更高的维修能力,因为没有要求修复模板(姐妹染色体或同源物)或广泛的DNA合成。NHEJ还完成了几十分钟内大多数休息的修复-速度比HDR快。因此,NHEJ是根据修复CRISPR / CAS9引入的断裂的原理意味着。

NHEJ维修需要以下因素,无论最终结构如何,并决定途径的主要事件:

  1. 断头可以通过加载来识别Ku70 / Ku80异二聚体
  2. KU随后用作脚手架,用于募集激酶(DNA-PKCS)和两个亚基DNA连接酶(XRCC4-ligase IV);一起与一些配件因素(PAXX, XLF),该复合物将一对DNA末端保持在一起,形成配对的末端复合物
  3. 配对的末端复合体然后将兼容的DNA末端连接在一起,从而修复断裂。

这是该途径的简化、简化版本,不考虑dsb生物源中常见的缺失或损坏的核苷酸,这些核苷酸需要处理。处理发生在连接之前,因为不相容的DNA末端干扰了这一步骤。因此,NHEJ有一个巨大的加工因子工具箱,包括聚合酶(Pol μ和Pol λ),核酸酶(Artemis),和结构特异性末端清洁酶(Aprataxin, Tdp2),使末端更好的底物连接功能。虽然我们在这里不描述这些步骤,DNA的处理结束往往是突变被引入的点。

NHEJ修复cas9诱导的断裂

如下所示,NHEJ介导的CAS9生成的断裂修复如果意图是在感兴趣的基因中敲门出来,则非常有用,因为它容易产生诱导误差。NHEJ维修过程中产生的indel错误通常很小(1-10bp)但非常异质。因此,大约有三分之二的机会导致颤音突变。在一些重要性中,当通过侧翼序列(“微泡沫学”)的序列同一性约束时,缺失可以不均匀。

非同源终端连接

NHEJ没有强制引入indels。鉴于Cas9 DSB的末端结构(钝端或近钝端没有核苷酸损伤),这种产物很少见,可能只占修复事件的不到5%。但是,精确修复的产品容易再裂,而indel产品不易再裂,所以重复的循环有利于后一种产品的积累。如上所述,一个切割和精确修复周期应该少于一个小时,因此,表达靶向Cas9的细胞群应该在一天内拥有大多数染色体的indels。另一个预计会影响修复的因素是,Cas9蛋白在裂解后不会立即从断裂端释放,这可能会干扰Ku的加载和正常的NHEJ活性。其他因素也会影响NHEJ活性。例如,抑制RecA和过表达NHEJ机制提高了NHEJ的精度msmegmatis(Yan等人,2020)。

NHEJ也可以通过规范CAS9方法的变体来参与。一对CRICPR导向器,侧翼区域数百碱基对或更高可以同时引入一对染色体断裂,并且如果NHEJ连接在一起,则可能导致缺失干预DNA(“弹出”缺失)。类似地,通过NHEJ依赖性修复(“弹出式”插入)直接将外源性DNA片段直接插入Cas9靶向断裂(或一对突破)。可用包含兼容外挂的模板.Cas9也可以通过改变产生单链断裂;当两个这样的断裂被引入到彼此附近,在相反的线。这种“双镍酶”策略极大地减少了脱靶位点的突变和断裂。

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Christina Mork对本文的更新做出了贡献。

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David_Wyatt-guest_blog

David Wyatt是一个对决定破损的结构如何影响它们的修复方式感兴趣的研究生。他在戴尔的实验室工作。

dale_ramsden-guest_blog.

戴尔·拉姆斯登是遗传学和分子生物学课程的成员,生物化学和生物物理学部和UNC教堂山的Lineberger综合癌症中心。

参考文献

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