CRISPR 101:核糖核蛋白(RNP)递送

Andrew Hempstead.

克里普尔克大大提高了科学家制造基因组改变的能力,引进了基因组工程的革命,具有新技术迅速发展。执行CRISPR实验需要,至少有两种组分:CAS9蛋白和指定您基因组患者的引导RNA(GRNA)。这通常通过用质粒转染细胞来进行,例如PX459,编码CAS9并包含插入自定义GRNA的站点。虽然这种方法已被证明对科学家令人难以置信的价值,但在使用此方法时必须考虑一些潜在的并发症:

  1. 必须允许细胞转染或病毒转导
  2. 必须为Cas9和GRNA表达选择合适的启动子
  3. 质粒DNA可以掺入基因组中
  4. 由于Cas9表达延长,可能会发生偏离目标效果
  5. CAS9转录和翻译延迟编辑的要求

什么是cas9-grna核糖核蛋白?

一种替代方法,避免了许多并发症,是直接提供核糖核蛋白(RNP),由Cas9蛋白与靶向GRNA复合物组成,对您的感兴趣的细胞。与Cas9 / GRNA的基于质粒的基于质粒的表达相比,CAS9 RNP能够以相似的效率裂解基因组靶标,并且可用于CRISPR的大多数目前的基因组工程应用,包括:产生单一或多基因敲门图在各种细胞类型中,基因编辑使用同源性定向修复(HDR),并产生大型基因组缺失

Cas9 RNPS的优点是什么?

使用RNP进行CRISPR实验有许多优点。

  • RNP方法通常可以用于难以转染的细胞,例如原代细胞。
  • 使用RNPS还可以缓解在细胞中发生的蛋白质表达的困难,其中常见的真核启动子(例如CMV或在许多CRISPR质粒中发现的CMV或EF1A启动子)的细胞中出现。
  • 因为该方法不需要递送异物DNA,并且CAS9-GRNA RNP随时间降级,使用RNP可以限制偏离目标效果的可能性。
  • Cas9 RNP在转染后不久的高水平可检测,并且通过蛋白质降解途径从细胞迅速清除。
  • 这使得CAS9 RNP适用于CAS9所需的有限表达并且特异性是一个问题,例如敲除产生或同源重组。但是,需要Cas9长期表达的实验,例如使用荧光团标记的DCAS9可视化基因组基因座可能需要使用质粒或病毒介导的递送。

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制备Cas9-Grna核糖核蛋白

这种CRISPR实验的第一步是产生RNP复合物的一代。虽然一个选择是从商业供应商购买Cas9蛋白和GRNA,但这通常是昂贵的。另一种方法是从中表达和净化他标记的CAS9大肠杆菌使用质粒如PET-28B-CAS9-他的Alex Schier的实验室。GRNA可以是体外从SSDNA转录,可以由商业供应商产生,例如IDT.。然后将这两种组分孵育在一起以形成RNP。概述这些步骤的详细协议已被均可公开提供雅各布玉米Alex Schier实验室。

提供CAS9-GRNA核糖核蛋白

显示CAS9-GRNA核糖核糖蛋白通过电穿孔,阳离子脂质介导的方法输送,并使用CAS9蛋白质携带受体配体的特定细胞类型的内化

使用RNP进行CRISPR实验的优点是可用于提供CAS9-GRNA RNP的各种方法。这一优势使科学家们可以执行体外体内在实验系统中的CRISPR研究可能不适用于基于质粒的方法。

递送RNP的最常见技术之一是电穿孔(上图中的A),其在细胞膜中产生孔,允许将RNP进入细胞质。除了在细胞培养中使用这种技术外,还通过称为称为的过程应用于小鼠Zygotes的基因组编辑CRISPR-EZ(R.R.NP.E.LectroporatoratoratorZ.ygotes)陈等。2016年)。对于涉及HDR的CRISPR实验,电穿孔可以在称为核膜中形成孔的技术中的细胞型特异性试剂组合,其在核膜中形成孔,允许进入DNA模板。

其他技术,例如脂质介导的转染(在上图中的B),是在发育的早期阶段。大卫刘的实验室已经证明了使用阳离子脂质介导的方法将CAS9-GRNA RNP递送到小鼠内耳中的毛细胞(Zuris等人。2015年)。最近描述了使用RNP的更具目标方法体外,希望最终使用这种方法体内应用程序。该技术利用Cas9蛋白质携带受体配体(C在上图中的C),这导致了特定细胞类型Cas9-GRNA RNP的内化Rouet等。2018年)。这是使用Cas9突变体(Cas9M1C / C80S)来完成的,该Cas9突变体(Cas9M1C / C80s)将两种表面暴露的半胱氨酸,包括天然C547,允许连接到吡啶基二硫化物活化的配体中。

由于偏离目标突变和作物中的转基因整合的担忧,将Cas9-GRNA RNP分配给植物作为基于质粒技术的替代方案,是一个激烈的研究领域。实现这两种方法是聚乙二醇(PEG)介导的原生质体的转染和未成熟胚胎的生物质轰炸(梁等人。2017年)。PEG介导的方法,虽然从技术上更少难以执行,通常表现出低效率,而生物轰击可以具有高效率,需要专门的设备,例如基因枪。根据实验的性质,由研究人员决定哪种方法最适合于给定实验。

用于RNP介导的CRISPR实验的考虑因素

在使用CAS9-GRNA RNP进行CRISPR实验的同时可以减少许多潜在的并发症,因此使用这些类型的实验考虑了其他因素。一个重要的考虑因素是CAS9-GRNA RNP随着时间的推移将被细胞降级。结果,RNP介导的CRISPR实验可能不适合于需要稳定的CAS9表达的实验,例如当将Cas9融合到荧光蛋白时用于标记核酸靶标。Cas9-Grna RNPS显示出来体内研究毫无疑问,关于宿主Cas9蛋白的免疫原性和稳定性。实际上,研究表明了一个Cas9蛋白来自Geobacillus stearothermophilus人体等离子体更稳定比标准的spcas9(Harrington等人。2017年)。最后,与任何科学研究一样,一种技术的选择通常会归结为研究员对不同系统的熟悉程度。在实验中使用CAS9-GRNA RNP可以需要蛋白质表达和纯化等步骤,这将需要额外的实验室试剂,设备和专业知识。

最后的想法

CAS9-GRNA RNP方法提供了科学家,具有额外的手段,以将CRISPR组件提供给他们的兴趣实验系统。使用这种方法可以减轻使用基于质粒的系统时可能出现的许多问题,最重要的是能够在难以转染或转染的细胞中进行CRISPR研究的能力。在使用CAS9-GRNA RNPS的同时可能需要在实验室中生产CAS9蛋白和GRNA,一旦获得了这些,可以迅速进行基因组编辑,在许多情况下,减少偏离目标效果的几率。随着CISRPR字段继续发展,rnps的使用可能会在其持续的进步方面发挥重要作用。


茅草Andrew Hempstead是Addgene的高级科学家。安德鲁的兴趣包括基因组工程和微生物学。

参考

1.陈,肖恩,等。“通过CRISPR核糖核蛋白电穿孔的高效小鼠基因组编辑Zygotes。”生物化学杂志(2016):JBC-M116。PubMed.PMID:27151215。pmed中央PMCID:PMC4938170

2。Zuris,John A.等人。“阳离子血液介导的蛋白质递送能够在体外和体内进行高效的基于蛋白质的基因组。”自然生物技术33.1(2015):73. PUBMEDPMID:25357182。pmed中央PMCID:PMC4289409

3.Rouet,Romain等人。“受体介导的CRISPR-CAS9内切核酸酶用于细胞类型特异性基因编辑的递送。”美国化学学会杂志140.21(2018):6596-6603。PubMed.PMID:29668265。pmed中央PMCID:PMC6002863.

4.梁,甄,等。“使用CRISPR / CAS9核糖核蛋白复合物的面包小麦的有效的DNA基因组编辑。”自然通信8(2017):14261。PUBMEDPMID:28098143.。pmed中央PMCID:PMC5253684.

5。Harrington,Lucas B.等人。“热稳定的Cas9,具有增加人体等离子体的寿命增加。”自然通信8.1(2017):1424。PUBMEDPMID:29127284。pmed中央PMCID:PMC5681539.

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