CRISPR 101:用CAS13a靶向RNA(C2C2)

由乔尔·麦克达德

这篇文章于2020年7月27日更新。

CRISPR,特别是Cas9链球菌(SPCAS9),真正是一个特殊的基因组工程工具。在大多数物种中易于使用,功能性,并且具有许多应用程序。也就是说,SPCAS9不是镇上唯一的比赛,而且其他CAS蛋白就像SaCas9Cpf1可以绕过与SpCas9相关的限制吗Cas13a(以前称为C2c2)有几个独特的属性,进一步扩展了CRISPR工具箱。我们将介绍Cas13a是如何被鉴定的,Cas13a的结构和功能,重点是什么使这个分子独特,以及Cas13a的各种应用。

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Cas13a的起源:RNA裂解CRISPR核酸酶

Cas13a是最初在2015年确定(Shmakov等人,2015)。他们使用Cas1该基因通常与CRISPR阵列相关,并参与感染后获得间隔物,作为一种“诱饵”形式,用于识别细菌基因组中新的CRISPR相关蛋白。从这个分析中,他们确定了53个潜在的候选基因,根据所研究的CRISPR蛋白的结构分为3类:C2c1、C2c2和C2c3(2类、候选1、2或3的缩写)。C2c1和C2c3是相关的Cpf1,但它们同时需要一个tracrRNA和crRNA来切割目标DNA (Cpf1只需要一个crRNA来识别和切割目标)。C2c2(现在被称为Cas13a)在结构和功能方面是独一无二的,因此将是本博文其余部分的重点。

也许Cas13a和Cas9之间最大的区别是,Cas13a结合并裂解RNA而不是DNA底物。在结构方面,Cas13a与最常用的CRISPR酶没有同源性——Cas13a包含两个HEPN结构域,而Cas9使用HNH和RuvC结构域来切割目标DNA。Cas13a中的HEPN结构域是RNA裂解的关键,这与其他蛋白质中已知的HEPN结构域的作用一致。与Cas9一样,突变Cas13a分子中的关键残基会导致“核酸酶死亡”Cas13a (dCas13a),其能够结合靶RNA但缺乏能够切割RNA靶标的能力。

表1:常见CRISPR酶的比较

名称 酶域 指导RNA 目标 PAM (PFS) 切割机制
Cas9 海航,RuvC

TracrRNA, crRNA

DNA

5 ' NGG

靶DNA中的特异性钝端DSB

Cpf1

RuvC-like

crRNA DNA 5 ' TTN 靶DNA的特异性DSB,具有5'悬垂
CAS13A(C2C2) 2x hepn. crRNA 核糖核酸

3' A, U,或C(不要求所有的同源)

特异性RNA裂解(其次是细菌中的非特异性RNase活性)

CAS13A靶向单个CRRNA

冯张实验室使用Cas13a from.纤毛菌属shahii(LshCas13a)开始表征这种新效应器(Abudayyeh等,2016)。在内源CRISPR / CAS9系统中,CAS9使用TRACRRNA和CRRNA分别促进靶DNA的结合和切割。另一方面,LSHCAS13A仅使用短〜24碱基CRRNA,其通过富含尿素的茎环与CAS13A分子相互作用,并通过CAS13A分子的一系列构象变化促进靶结合和切割。与CAS9一样,CAS13A耐受CRRNA和靶序列之间的单一不匹配,但是当存在2个错配时Cas13a的切割效率降低。用于LSHCAS13A的原始晶圆序列(PFS),类似于PAM序列对于Cas9,位于间隔序列的3 '端,由单一的a、U或C碱基对组成。

在细菌中,一旦Cas13a按照crRNA序列的要求识别并切割其目标RNA序列,它就会进入酶的“活性”状态,而不是像Cas9或Cpf1那样恢复到非活性状态。因此,Cas13a会结合并切割额外的rna,无论其与crRNA是否同源或是否存在PFS。这与Cas9形成了鲜明的对比,Cas9要求每个DNA目标与间隔序列具有高度的序列一致性,并包含适当的PAM序列。这种非特异性的分裂被认为可以激活被噬菌体感染的细菌细胞的程序性死亡或休眠状态,以限制感染在整个种群中的传播。Cas13a的这一特性为使用Cas13a作为诊断工具开辟了可能性,如下所述。

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应用Cas13a

使用CAS13作为诊断工具的步骤。首先将核酸扩增或转录成RNA。如果CAS13蛋白根据CRNA的指示切割RNA片段,则它将开始切割任何和所有RNA,包括荧光RNA报告器。

Cas13a给出了我们对其结构和功能的了解的潜在应用?对于初学者,CAS13A可用于结合和切割靶RNA,尽管其在细菌细胞中的用量可能受CAS13a的倾向而无限地结合和切割RNA的限制。DCAS13A结合靶RNA的能力而不切割分子(如DCAS9)表明DCAS13A可用于分离来自群体的特异性RNA序列(富集或耗尽RNA池中的特异性RNA)或研究RNA加工细胞。实际上,组利用DCAS13融合蛋白进行成像,跟踪,调节剪接和特异性靶向RNA的表达。

最后(也许最有趣的),Cas13a在结合用户定义的RNA序列后切割任何RNA的倾向用于检测具有高特异性的单分子的RNA物种(Gootenberg等人,2017)。这个系统,被称为《神探夏洛克》(如图1所示)已被用于区分寨卡病毒毒株,人类DNA基因型,在细胞游离基因组DNA中识别肿瘤突变,以及检测COVID-19(Joung, Ladha等人,2020)。

哺乳动物细胞中的Cas13a

张实验室有了令人兴奋的发现Cas13a Orthologs可以在哺乳动物和植物细胞中起作用(Abudayyeh等人。,2017)。它们从LeptoTrichia Wadei(Lwacas13a)中的Cas13a表征了Cas13a,使用超级折叠GFP融合来稳定哺乳动物细胞中的蛋白质。lwacas13a-msfgfp.可以在长度为20-28个核苷酸的裂缝中调节裂解,并且不需要特定的PFS,使其成为非常柔性的切割系统。LWACAS13A也适用于多路复用;表达5 GRNA同时产生可比较的基因敲低对单个GRNA表达。

尽管侧枝RNA裂解反应在细菌细胞中已经得到了很好的描述,LwaCas13a在真核细胞中不显示非特异性RNA裂解活性。他们通过对整体RNA表达、细胞应激和RNA大小分布的分析得出了这一发现。当将LwaCas13a与shRNA进行比较时,他们发现LwaCas13a表现出相似的敲除效率,但没有显著的脱靶效应,这与观察到的数百个脱靶的shRNA形成了鲜明对比。他们随后使用催化活性dLwaCas13a作为可编程RNA结合蛋白,创建荧光融合蛋白dLwaCas13a- nf用于体内RNA成像。

简而言之,CAS13A分子为CRISPR工具箱带来了许多预期的多样性元素,并将继续扩大CRISPR的应用。自该帖子最初发布以来,我们还看到Cas13b作为工具的新开发RNA编辑基础,我们很高兴看到这群酶继续在Crispr域中发出飞溅。我们认为,在CRISPR社区内的分享文化是该领域快速技术发展的重要组成部分,我们始终如一,我们很高兴能够与科学界共享这些宝贵的试剂。


注意:Cary Valley和Mary Tearing致力于更新这篇文章。

参考文献

1.Abudayyeh, Omar O等人。C2c2是一种单组分可编程rna引导的rna靶向CRISPR效应器。科学353 (6299) (2016): aaf5573。PubMed.PMID: 27256883。pmed中央PMCID: PMC5127784

2. East-Seletsky,Alexandra,等。“CRISPR-C2C2的两个不同的RNA酶活性使能导向RNA处理和RNA检测。”自然538(7624)(2016): 270 - 273。PubMed.PMID: 27669025

3.Gootenberg, Jonathan S.等。“CRISPR-Cas13a/C2c2核酸检测。”科学(2017):EAAM9321。PubMed.PMID: 28408723。pmed中央PMCID:PMC5526198

4.East-Seletsky, Alexandra等人。功能正交型VI-A CRISPR-Cas酶靶向RNA摩尔细胞。66(3)(2017): 373 - 83。PubMed.PMID:28475872

5。Abudayyeh, Omar O等人。“RNA瞄准CRISPR-CAS13。”自然550(7675)(2017): 280 - 284。PMID:28976959

6。Shmakov, Sergey等。“不同的2类CRISPR-Cas系统的发现和功能表征。”分子细胞60.3(2015):385-397。PubMed.PMID: 26593719。pmed中央PMCID:PMC4660269.

7. Joung J,Ladha A等人,'Covid-19使用Sherlock Diagnostics的护理点测试。medRxiv2020年5月8日。PubmedPMID:32511521。pmed中央PMCID: PMC7273289

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