CRISPR 101:验证您的Genome编辑

由美琳娜迷

迈克尔·勒米厄于2020年10月9日更新。

您已创建了GRNA表达构造并使用CAS9将其引入目标单元格。h你准备开始阅读数据,对吗?几乎。在本博客文章中,我们将解释如何验证您的细胞是否被适当编辑。我们还将涵盖用于检测插入,删除和突变事件的基本技术。

下载Addgene的CRISPR 101电子书!

过程概述

验证您的基因组编辑的方法将因物种和编辑的类型而异。在这篇文章中,我们将关注二倍体哺乳动物细胞,但许多原则适用于不同的模式生物。

将Cas9和gRNA引入你的细胞(可能与供体模板一起)会产生混合细胞群。在哺乳动物细胞中引入cas9介导的双链断裂(DSB)后,细胞机制通过异源端加入(NHEJ)或同源性定向修复(HDR)。通过NHEJ途径修复哺乳动物细胞中的占主导地位,从而产生诱导误差,短缺Sertions和在DSB的位点处的核酸序列的优化。除了在Cas9诱导的DSB中引入的吲哚的异质性之外,等位基因编辑频率也会变化。HDR途径需要存在修复模板,用于以更具体的方式固定DSB。HDR忠实地将修复模板的序列复制到截止目标序列。一些细胞不会被编辑,有些细胞将编辑一个等位基因,有些则会有两位等位基因编辑。

基因组编辑验证工作流程。如果Cas9在没有HDR供体的情况下切断基因组,则会产生一个indel。通过错配裂解试验检测Indels,然后具有所需突变的细胞可以克隆扩增。如果Cas9在HDR供体存在的情况下剪切基因组,那么由于DNA的同源性指导修复,这个供体可能被引入剪切位点。然后,PCR被用来筛选包含所需插入的细胞。插入所需的细胞可以克隆扩增。

验证过程中的第一步是快速评估是否已编辑了大量的单元格(参见图1)。对于诱导,这是使用不匹配的裂解测定来可视化(参见图2)。对于HDR,这通常通过感兴趣部位或通过记者读数的限制模式的变化来可视化。对于缺失(参见图3),这通过由待删除区域的引物侧翼的引物产生的PCR产物的大小的减小来显现。

一旦您知道已经编辑了一部分单元格,您可以继续创建克隆单元格。串行稀释液可用于隔离单个单元,然后进行扩展时间以产生这些线。如果在质粒上有荧光蛋白标记物,则可以使用FACS来丰富接受CAS9和GRNA的细胞。After expansion, assay each cell line and sequence the region of interest in order to validate the genome edit as described in Figure 1. But don’t stop there, because you can potentially validate your edit at four different levels (DNA, RNA, protein, and phenotype). Depending on the nature of your edit, something like qRT-PCR could be used to demonstrate a difference in mRNA transcript levels. A western blot can assess protein expression, and phenotypic analyses will be crucial to demonstrate the functional consequences of your edit. We’ll focus mostly on validation at the DNA level in this post, so read on to learn more!

不匹配的切割测定以检测indels

用CRISPR检测indels生成的错配裂解法或测量法概述。通过PCR扩增DNA突变区,然后变性和再杂交。然后用测量者核酸酶处理样本,它可以消化不匹配的DNA。然后样品在凝胶上运行,在凝胶中,裂解的DNA从未裂解的DNA分离出来。

不匹配的裂解测定是一种检测indels的快速简便。验船师TM值核酸酶通常用于此目的,因为它将DNA链3'切割到任何不匹配的情况下。它可以检测多达12个核苷酸的诱导,并且对32份中的频率存在的突变敏感。

不匹配的切割测定通常由四个步骤组成:1)PCR扩增感兴趣的区域,2)使股线变性并再杂化以允许突变体和野生型链,3)用测量师治疗退火DNATM值核酸酶到裂解异水解,4)分析琼脂糖凝胶或基于尺寸的其他仪器上的DNA。图2说明了测定的工作原理。在该示例中,两个+ GRNA泳道含有预期尺寸的切割片段,表明GRNA在目标区域中成功产生了诱导。该测定通常是半定量使用的,在这种情况下,GRNA1似乎在产生比GRNA2的吲哚更有效。这是因为GRNA1上的凝胶上的下分子量带的强度更大,这表明它产生了更多的诱导仪表被测量师识别和切割TM值核酸酶。

如果您更喜欢替代不匹配的切割测定作为半定量检测indels的方法,您也可以尝试RFLP分析。RFLP代表限制片段长度多态性,并且可以在诱导或取消限制内切核酸酶识别位点时使用。在靶区域的PCR扩增之后和随后用适当的酶消化,可以在琼脂糖凝胶或基于尺寸分离DNA的琼脂糖凝胶或其他仪器上进行DNA,并分析的限制模式确定多克隆细胞群中的诱导性形成程度。RFLP分析具有在不匹配的切割测定上具有优势,因为它可以检测纯合突变。主要缺点是您必须有一个改变的限制识别站点,以便采用这种方法。

检测同源性定向修复

如果你想用HDR突变你感兴趣的区域,建议首先确定你的gRNA是否通过创建indels和进行错配切割实验有效地切割你的目标序列。一旦你选择了你的最佳gRNA,引入它连同Cas9和你的修复模板来驱动HDR。

在设计HDR捐赠者模板时,计划前进以检测集成事件。例如,您可以故意介绍或去除会改变PCR产品的消化模式的限制性位点。或者,您可以包括用于检测DNA,RNA或蛋白质水平的HDR的报告元素。在整合之后的大型插入或缺失也可以通过PCR产物中的尺寸变化来检测。如果多态性产生/去除限制性消化部位,则可以使用限制性消化快速测定单核苷酸变化。否则,可以通过Ta克隆和桑克序列,下一代测序或液滴数字PCR基因分型来检测单核苷酸变化。

请记住,进行连续稀释和产生克隆细胞系将有助于验证您的基因组编辑。这是因为CRISPR-Cas9系统在种群的不同细胞间进行不同的编辑,这可能会使你的结果难以解释。例如,如果你对一个混合种群进行测序,你会在桑格测序色谱图中看到许多重叠的峰。桑格扩增子测序可以让你大致了解发生了一些编辑,但你不知道哪些细胞被成功修改了。

HDR事件通常比Indels更少频繁,因此您可能需要筛选更多数量的殖民地来创建克隆线。需要筛选的克隆数将取决于转染/转导效率和HDR频率。例如,如果您有40%的转染效率和5%HDR效率,约为0.4x0.05 = 0.02或2%的细胞将具有重组区域。因此,您应该计划筛选至少50个殖民地。如果您能够使用标记选择已成功转染/转换的单元格,则可能能够测试更少的殖民地。

在CRISPR基因分型的测序选项上查看我们的帖子

PCR检测缺失

大多数缺失是通过使用两个gRNAs来引导Cas9切割出DNA的中间区域。因此,该缺失可以通过使用引物在缺失区域的侧翼进行PCR检测。该工作流与图1中描述的类似。图3提供了通过筛选一组克隆系的缺失得到的PCR结果示例。在本例中,克隆1、5和7在删除时是杂合的,克隆4在删除时是纯合的。

使用PCR鉴定含有所需CRISPR缺失的克隆。

使用Digital PCR查看我们的博客文章以验证您的Genome编辑

下一代测序以验证编辑并检测脱靶效果

如果您的实验室具有资源,可以使用下一代测序(NGS)定量地评估目标序列和基因组的其他区域的基因组编辑。如果您有大量样本和/或想要同时查看偏离目标更改,则NGS是一个很好的选择。使用此方法时,重要的是要保持一套控制细胞作为您需要将编辑过的样本的测序读数与未处理的样本进行比较。等软件Crispresso.可以帮助数据分析。

但如果你的实验室没有NGS的资源怎么办?你仍然可以选择检测脱靶效果。你可以使用桑格测序,只要你知道在基因组的什么地方可能会发生偏离目标的编辑。使用在Silico.预测分析等Crispritz.或者陶器可以帮助缩小可能发生OFF目标编辑的网站列表,允许您扫描序列允许的较高概率位置的可管理数量。

如果您担心偏离目标效果,您也可以考虑使用一版本的CAS9,该版本已经专门设计用于减少目标编辑,例如SPCAS9-HF1,ESPCAS9(1.1)或Hypacas9。

这篇文章中描述的技术不是特定的crispr,也可以用于评估编辑的基因组talen.或者锌手指核酸酶。无论您使用什么方法,验证您的编辑都是在为将来的实验做准备时花费的时间。


谢谢大卫斯科特(冯张博士的实验室),Joel McDade(Addgene),以及Marcy Patrick(Addgene),有用的评论和编辑。

参考

Cancellieri S,Canver MC,Bombieri N,Giugno R,Pinello L(2019)Crispritz:在Silico非目标网站识别中迅速,高通量和变体意识到Crispr基因组编辑。生物信息学36:2001-2008。https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btz867

Haeussler M, Schönig K, Eckert H, Eschstruth A, Mianné J, Renaud J-B, Schneider-Maunoury S, Shkumatava A, Teboul L, Kent J, Joly J-S, Concordet J-P (2016) Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol 17: .https://doi.org/10.1186/s13059-016-1012-2

Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F(2013)基于CRISPR-Cas9系统的基因组工程。Nat协议8:2281-2308。https://doi.org/10.1038/nprot.2013.143

邱平,Shandilya H, D 'Alessio JM, O 'Connor K, Durocher J, Gerard GF(2004)使用Surveyor™核酸酶进行突变检测。生物学技术36:702 - 707。https://doi.org/10.2144/04364pf01

在Addgene中查找更多Crispres资源:

CRISPR质粒在Addgene.

计划您的下一个CRISPR实验,点击立即在Addgene开始

主题:CRISPR,www.vw011.com

发表评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅