CRISPR-Cas14:一个能够实现高保真SNP基因分型的小dna靶向酶家族

由Benoit Giquel

上次更新了4月17日,2020年4月17日。

Cas14可用于检测ssDNA。一旦它与ssDNA结合,它就能使探针变成荧光在科学家改编之前,在这个星球上编辑几乎任何生物的基因组,Carrpr-CAS系统仅仅是适应性免疫系统,可提供针对传染病的细菌保护。已经发现并研究了这种免疫背后的几种酶,但它只是冰山的尖端,因为它已经预测,许多其他人仍然未知。

识别Cas14变体

在探索新的、或许更有效的Cas系统的过程中,詹妮弗Doudna的实验室分析了MetageNomic数据集,以确定更简单,也许更小的CAS系统是否存在于自然界中。

为此,他们从能源部的联合基因组研究所挖掘了一个微生物基因组和宏基因组数据库,其中包含了接近CRISPR阵列和通用CRISPR整合酶的未特征基因,cas1。他们发现了一个CRISPR-Cas系统家族包含cas1,cas2,cas4和一个新的基因cas14cas14编码一个小型Cas蛋白(40-70 kDa),这是在所谓的2类CRISPR-Cas系统中发现的其他Cas蛋白的一半大小。

有24种变体cas143个亚组的基因(cas14a-c)。所有这些变体都有一个预测的RuvC核酸酶结构域,这是CRISPR-Cas酶的特征。与其他Cas酶相比,Cas14尚未在细菌基因组中发现,而仅在一组古细菌基因组中发现。与这个起源一致,作者认为Cas14可能是更大、更复杂的Cas9和Cas12蛋白的一个更原始的版本。

Cas14劈开ssDNA

但是这个新系统的功能是什么呢?它能成为基因组编辑的新工具吗?为了测试Cas14的潜力,杜德纳实验室克隆了cas14基因与邻近的CRISPR阵列和基因间区域包含假定的tracrRNA进入一个质粒用an表示E杆菌细菌菌株。他们发现Cas14可以结合和切割ssDNA的目标序列。与Cas9不同,Cas14不需要PAM序列。除了这种顺式切割,作者还发现Cas14可以像Cas13和Cas12分别对RNA和dsDNA那样,不加区别地反式切割ssDNA。然而,作者发现Cas14对ssDNA的识别比Cas13或Cas12对其他类型的核酸的识别更特异,需要在gRNA中间有一定的序列特异性才能被激活。

CAS14在诊断中

通过切割ssDNA而不是dsDNA Cas14不是一个新的基因组编辑工具的好候选,但它可能是一个很好的诊断工具包,称为DETECTR,这是由作者创造的。该套件使用CAS12和CAS13快速检测传染性生物的存在(例如:SARS-CoV-2)和遗传突变。例如,通过提供特异性病毒序列的GRNA,酶被激活,并且可以在反式中切割DSDNA和RNA的荧光探针。荧光信号表明在测定中存在这种病毒序列。

通过加入Cas14,你得到了最终的组合,使RNA、dsDNA和现在的ssDNA能够检测。通过比较Cas12和Cas14使用DETECTR试剂盒检测SNP的能力,作者发现Cas14提高的特异性可以实现高保真SNP基因分型。Cas14-DETECTR的开发将很快使快速和有效地诊断感染、癌症和其他疾病成为可能。


参考

1.哈林顿,卢卡斯等人。"通过微型CRISPR-Cas14酶编程DNA破坏"科学362.6416(2018): 839 - 842。PubMed IDPMID: 30337455

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