细菌CRISPR方法:基因组工程,CRISPRa, CRISPRi,碱基编辑等

由玛丽传动装置

最初发表于2016年3月3日,最后更新于2021年4月13日,作者Will Arnold。

虽然CRISPR系统最初是在细菌中发现的,但大多数基于CRISPR的基因组工程已经在其他生物体中发现。与其他生物体不同,在许多细菌中,crispr诱导的双链断裂是致命的,因为异源end-joining (NHEJ)修复途径不是很健全。在许多情况下,homology-directed修复也不能有效地发挥作用,但是科学家已经设计了利用噬菌体遗传系统来促进细菌中的同源重组的方法。这些怪僻改变了CRISPR介导的基因组工程在细菌中的功能,但不用担心——来自Addgene存贮者的质粒使CRISPR比以往任何时候都更容易在细菌中使用大肠杆菌还有其他细菌种类。继续读下去,了解细菌可用的工具和它们的一些应用。
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细菌克里普尔工程的开始

完成细菌基因组工程的一种常见方法是用recombineering,一种利用噬菌体重组机制促进线性DNA片段同源重组的技术。由于重组不包含成功修改的选择步骤,效率可能很低,特别是对较大的修改。

这种低效率的解决方案是什么?使用CRISPR以使其成​​为可选过程!由于NHEJ在细菌中无效,CRISPR诱导的双链破裂(DSB)是致命的。Addgene存款人Luciano Marraffini的实验室利用这种杀伤力来设计第一个合成的细菌克里普尔系统大肠杆菌。可从Addgene获得的系统由两种质粒组成:

  1. PCAS9.:带Cas9和氯霉素抗性
  2. pCRISPR:携带靶向目标基因和卡那霉素耐药的间隔层

大肠杆菌首先用pCas9对噬菌体重组装置进行电穿孔。然后,将pCRISPR和寡核苷酸修复模板一起引入。通过重组,将感兴趣的位点进行修饰,使其与修复模板匹配,该位点不能被间隔区衍生的crRNA识别。然而,如果重组失败,而野生型序列持续存在,Cas9将切割目标基因,诱导致命的DSB。

如何使用Crispr用于细菌基因组工程

该系统与真核生物中使用的系统不同,因为CRISPR不是主要编辑力。相比之下,在大肠杆菌,CRISPR主要是选择靶向未发生同源重组的细胞的方法。这种强大的负选择系统可确保高编辑效率;唯一的未编辑细胞存活地具有Cas9或间隔序列中的突变,并且可以使用PCR易于检测这些罕见事件。该系统还在运用肺炎链球菌并且可用于同时生成多个突变(Jiang等,2013)。

细菌基因组编辑工具

CRMAGE系统结合了CRISPR和基于重组的MAGE

尼尔森实验室的CRMAGE系统是一种快速、多路复用的方法,结合了CRISPR和基于重组的MAGE(多路自动化基因组工程)技术(Ronda et al., 2016)。pMA7CR_2.0表达λ红色和Cas9,分别由L-阿拉伯糖和Anhydrootetracycline(atet)分别诱导。pMAZ-SK包含一个aTet诱导的gRNA和一个针对主干的gRNA盒,用于在l -鼠李糖和aTet诱导后通过“自毁”治愈质粒。CRMAGE比传统重组更高效,对于点突变有96-99%的效率,对于小插入有66%的效率。可同时复用两个目标,效率>70%。CRMAGE是一种非常快的协议,单轮编辑只需要5小时的潜伏期,后续的治疗协议只需要2-3小时的潜伏期。

大肠杆菌t . citrea无疤编辑质粒

盛阳的实验室描述了一个双质粒系统,结合重组和CRISPR创造一个无疤痕,迭代的基因组工程系统(Jiang et al., 2015)。pCas包含Cas9和噬菌体重组基因lambda Red。Ptargetf.含有特异性GRNA,并且修复模板作为DSDNA片段提供。每一轮编辑需要两天,并且Ptargetf和PCAS质粒可以随后从细菌固化。虽然开发了大肠杆菌,该系统已成功应用于Tatumella citrea,另一种肠杆菌科,无需修改。这一发现表明系统可以在最多的情况下是功能肠杆菌膜。

这个系统的更新,叫做pEcCas / pEcgRNA,允许它在更多的使用E.杆菌包括流行的BL21(DE3)(Li等人,2021)的菌株。此PECCAS / PECGRNA系统与原始PCAS / PTargetF类似,但还有许多其他优点,包括更短的质粒固化时间。

pCRISPomyces编辑链霉菌

链霉菌细菌产生各种各样的生物活性天然产品。在该属内轻松探索和工程师途径,赵家的实验室创建两个“pCRISPomyces”系统用于链霉菌(Cobb等,2015)。pCRISPomyces-1包含Cas9、一个tracrRNA和一个CRISPR数组,而pCRISPomyces-2包含Cas9和一个gRNA盒。更简单的pCRISPomyces-2系统显示出更高的编辑效率,这可能是因为它的浓缩设计。对于这两种系统,定制的间隔物/gRNAs可以很容易地使用BbsI和金门组件。可以使用Xbai进行质粒化,以插入额外的元素,如修复模板,使用吉布森大会或者限制性内切酶克隆。链霉菌细菌更重组大肠杆菌因此,该系统功能更类似于CAS9介导的乳沟中适于真核生物的CRISPR / CAS9系统,诱导HDR直接修饰给定基因。

CRISPR-TRANPOSONS.

通过结合CRISPR编辑和转座子,Sternberg和Zhang实验室开发了CRISPR转座子。Sternberg实验室的系统被称为INTEGRATE(插入转座因子的引导rna辅助靶向)和Zhang实验室的系统被称为CAST (crispr相关转座酶)都能实现grna导向的转座。integration由四个主要成分组成,包括(1)一个CRISPR RNA,(2)与crRNA形成QCascade DNA靶向模块的四个蛋白质,(3)三个转座酶蛋白,(4)供体DNA。通过使用多间隔CRISPR阵列,CRISPR转座子可以多路复用。

细菌中的转录镇压(Crispri)

由于RNA干扰在细菌中不起作用,大多数调节基因表达的努力仅限于诱导启动子或直接敲除基因。相比之下,CRISPR提供了一种更加友好的方式来调节基因表达。Marraffini实验室气实验室开发了大肠杆菌的早期系统;虽然是马拉维尼实验室使用了本机最小的CRISPR数组(Bikard et al., 2013), Qi实验室聘请了一名基于GRNA的设计在真核生物中使用CRISPR的人更熟悉(QI等,2013)。如在其他系统中,靶向启动子或基因体的催化死(DCAS9)可以通过物理地阻断伸长型复合物与结合DNA或延伸转录物来抑制转录。不同的CA晶片和亚型函数略微不同,并且可以更有效地靶向启动子或编码序列和模板或非模板股,以及其他参数。。

Stanley Qi实验室的CRISPRi质粒

Stanley Qi的实验室证明了一个最小的、可调节的CRISPR系统有效地抑制了大肠杆菌中一个或多个基因的转录。和哺乳动物细胞系(Qi et al., 2013)。这一早期系统的两个重要特征是其可调节性和多重抑制的能力。使用Tet响应启动子来驱动催化死亡Cas9酶的表达可以实现基于诱导物存在的可逆抑制,在这种情况下是无水四环素(aTc)。通过克隆gRNA盒的两个串联副本,可以可靠地同时敲低多个靶转录本的表达。

Marraffini实验室的CRISPRi/a质粒

此外,早期工作的马拉菲尼实验室开拓性的基因组编辑使用CRISPR在细菌中,他们还领导了早期的工作,为CRISPRI和CRISPRA.(Bikard et al., 2013)。通过单独靶向催化死亡的Cas9 (dCas9)或融合到RNA聚合酶的omega亚基上的dCas9,该实验室成功地抑制或激活了大肠杆菌中选定基因的转录。此外,为了证明更广泛的适用性,他们证明了Cas9介导的抑制在革兰氏阳性细菌中的成功,链球菌引起的肺炎

罗伯特·胡森实验室的m结核CRISPRI质粒

来自Husson实验室的一个小组使用CRISPRi研究结核分枝杆菌的必要基因。dCas9和一个gRNA表达于pRH2502PRH2521.,分别。dCas9和gRNA都是tet诱导的,gRNA可以通过BbsI轻松克隆到pRH2521中。该系统可导致每个基因的多个gRNAs 80-90%的RNA敲低(singh等。2016年)。

莎拉财富的实验室m结核CRISPRI质粒

我们注意到,更常见的spCas9系统通常效率较低,或者在用于分枝杆菌物种时可能具有蛋白质毒性,莎拉财富的实验室筛选其他11个Cas9同源物,以确定一种更有效、耐受性更好的Cas酶。他们鉴定出Cas9的同源物来自乳酸链球菌,Cas9sth1作为转录沉默的鲁棒和高活性的酶结核分枝杆菌分枝杆菌smegmatis。除了鉴定出一种新的CRISPRi工具,他们还通过调节PAM进一步调整敲除效率来优化系统,并开发了新的、更严格控制的Tet响应启动子,以避免系统的泄漏激活。

移动CRISPRi用于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌

杰森·彼得斯奥伦罗森博格,卡罗总使用了两种不同的遗传系统,针对革兰氏阴性菌或革兰氏阳性厚壁菌门将CRISPRi应用于更广泛的细菌物种(彼得等,2019年)。系统的不同之处在于如何引入CRISPRI基因座(TN7以克阳性和ICEB1为单位),但共享用于靶向抑制基因表达的常见CRI-DCAS9系统。他们成功地在各种细菌中击倒了必需和非必要基因的表达,包括集合,基因组的格式。有兴趣了解更多吗?看看我们的移动CRISPRi博客文章

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CRISPR激活(CRISPRa)

虽然转录的激活是一个比抑制更具挑战性的问题,但科学家们已经沉积了几种可以以这种方式使用的质粒工具。如上面的Crispri部分所述,Marraffini Lab发布了一种强大的工具CRISPRI和CRISPRA.使用RNAP-OMEGA-DCAS9融合。这是其他人。

基于SOX的Crispra.

在寻找一种CRISPR激活方法中大肠杆菌,Jesse Zalatan的实验室使用一个方法鉴定参与转录激活的已知蛋白质包括转录因子、噬菌体蛋白和RNAP成分(Dong et al., 2018)。他们发现了一种名为SoxS的CRISPRa转录因子。为了增加复杂性,他们发现他们还可以包括用于多路调制的CRISPRi系统。

来自sigma-54启动子的CRISPRa

注意到以前的细菌克里帕克的工作侧重于西格玛-70依赖的启动子,宝君王的实验室开发了一个可以的系统激活sigma-54依赖启动子(刘等人。,2019)。虽然Sigma-70启动子是普遍存在的,但它们不是普遍的,特别是当涉及非模型细菌时。作者能够将DCAS9变体设计成融合的σ-54型启动子所需的细菌增强剂结合蛋白。该系统在激活启动子中具有功能性Klebsiella催产症

微生物胺工程

科学家们已经开始意识到CRISPR技术对人类微生物群的潜在影响。你可以把微生物群看作是占据肠道的生物体、它们的基因和代谢过程的集合。许多人类疾病与特定的生物体或生物体/基因与宿主的相互作用有关。

此方案允许多个潜在的CRISPR应用程序。首先,CRISPR可用于靶向致病或不期望的细菌的基因组中的位置。该系统可以多种方式递送,但是通过噬菌动物(Selle等,2020年Citorik等人,2015Bikard等人。,2014年)。当CRISPR系统靶向这些基因组位置时,并引入双链断裂时,细菌无法解决它们,并且细胞死亡。

这可以应用于仅存在单一生物体的疾病,例如Clostridium艰难术,可以被瞄准并优先从肠道耗尽。虽然离诊所还很远,仅为这样的目的(Selle等,2020),Carp-Cas3系统已成功使用在小鼠中(Selle等,2020)

以群体中的一部分细菌为目标

Lu实验室的工作发现使用CRISPR-Cas早期成功目标细菌亚群(Citorik et al., 2014)。这些可能是基因,特定的多态性,包括抗生素抗性基因。当将噬菌体或可移动的质粒引入种群时,这种方法成功地针对特定的生物体。

设计蜜蜂肠道微生物群

除了人类肠道之外,巴里克实验室还沉积了可用于改造蜜蜂肠道微生物群的质粒。他们创造了一个模块化系统使用了广泛的宿主范围的质粒这可以在蜜蜂和大黄蜂肠道微生物群的原生细菌中保持蜜蜂microbiome toolkit(Leonard等,2018)

基础编辑

利用CRISPR-Cas系统卓越特性的最新方法之一是碱基编辑。这一过程通常通过融合一种酶来完成,这种酶能够将一个碱基转化为另一个碱基,形成dCas9。然后使用典型的gRNA靶向方法将复合物导向一个特定的位点。这种方法提供了更细粒度的控制级别,可以修改单个基。

胞嘧啶核苷脱氨酶PmCDA1

近藤明彦的实验室发现了一种胞苷脱氨酶PmCDA1,它可以高效地与dCas9融合在目标序列中引入胞嘧啶到胸腺嘧啶的替换(Banno等人,2018)。这些替换被限制在目标序列的大约5个碱基对窗口,可以通过改变sgRNA的长度进行调整。通过在融合蛋白上添加尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂和降解标记,可以进一步细化系统,以限制整个系统的活性。

pseudomonas种类的胞苷脱氨酶

JI Lab带来了将此工具扩展到其他生物体假单胞菌的基因组和碱基编辑(Chen等人,2018)。利用胞苷脱氨酶、APOBEC1和Cas9的nickase版本,他们可以有效地引入点突变铜绿假单胞菌,假单胞菌putida假单胞菌荧光,。这些载体含有易于克隆gRNA的BsaI位点。

链霉菌胞苷和腺嘌呤碱基编辑

一些最工业和临床相关的细菌物种居住在链霉菌属,但基因组工程仍然是挑战的大多数生物体在该属。工作从太阳实验室展示胞苷和腺嘌呤碱基编辑器的效用,使c到t和a到g碱基替换分别。当使用Cas9的nickase版本时,替换似乎是最有效的,但也成功地使用了dCas9变体。此外,它们提供了BE3的高保真(HF)变体,进一步提高了编辑率。

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参考

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