CUT&RUN:一种研究蛋白质- dna相互作用的改进方法

由Guest Blogger.

本文由北卡罗来纳大学教堂山分校的研究生,客座博客Matthew J. Niederhuber撰稿。

染色质免疫沉淀后的高通量测序,ChIP-Seq,是定位蛋白质结合全基因组的最佳方法,并已广泛应用于许多模式生物和细胞系。虽然ChIP-seq是一个相对简单和健壮的协议,但它确实有局限性。以酶为基础的CUT&RUN方法克服了许多这些限制,使你更容易绘制蛋白质- dna相互作用与有限的生物材料。

芯片SEQ问题

  • 芯片SEQ通常需要大量的输入材料,细胞或组织,以在背景噪声中产生足够的信号。当使用细胞培养时,这并不是一个严重的问题,因为很容易获得大量的细胞。然而,当在整个动物模型中研究特定的组织或器官时,比如果蝇在美国,为ChIP-seq实验获得足够的材料可能是一个主要的技术障碍。

  • 芯片SEQ在初始固定步骤中需要交联。这有助于稳定DNA-蛋白质相互作用以通过SONERYERY进行随后的DNA。虽然它有助于捕获较弱或更高的瞬时DNA - 蛋白质相互作用,但对固定的依赖确实增加了假阳性的可能性,因为当实际上它们只是非特异性或间接相互作用时蛋白质可能在特定基因组位点具有结合。

急忙逃走的方法

进入急忙逃走这是一种基于酶的识别DNA结合模式的协议,克服了ChIP-seq的一些限制。CUT&RUN代表的是“在目标下切割和使用核酸酶释放”,是最近由Henikoff实验室在华盛顿大学。CUT&RUN不需要固定,显著降低了背景噪音,减少了测序时所需的读取深度,并降低了每次实验所需的组织数量。

在里面麦凯实验室我们研究了如何在开发期间控制转录监管要素的差异性程度果蝇翼作为模特。典型的芯片SEQ实验需要大约1,000个翅膀。收集大量组织需要一周的多个人进行解剖。通过切割和运行,我们的翅膀具有显着较少的成功,因此可以在一天内容易地收集对实验的足够的组织。

急忙逃走示意图

通过使用蛋白质A稠合的微核核酸核酸酶(MNA酶)的DNA切割活性来切割和运行工程,以特异性地分离由感兴趣的蛋白质结合的DNA。首先,使用凝胶涂覆的磁珠分离来自组织或细胞培养的核。然后将核与抵抗感兴趣的蛋白质的一抗孵育。然后加入蛋白质融合的MNA酶,并将蛋白A结合免疫球蛋白G(IgG),从而靶向MNA酶至抗体结合蛋白质(图1)。重要的是,由于蛋白质A对小鼠IgG具有较弱的亲和力,因此在加入蛋白质a mnase之前,在使用非兔伯酮时,可以与兔二抗孵育有助于。

一旦Mnase已经定位到靶位点,就会简要激活核酸酶以在靶蛋白周围消化DNA。该靶向消化是通过添加钙来控制的,MNA酶需要其核酸酶活性,并从反应中螯合直至这一点。核酸酶反应在冰上进行,并且仅在短时间内进行,从而精确地控制偏离靶消化产生的切割量和减轻噪声。在MNA酶消化后,在37的短暂孵育中,碎片从核释放°C.这些短的DNA片段可以被纯化,用于后续的文库制备和高通量测序。

改进了CUT&RUN方法,并在自己的实验室中使用它

最近,Henikoff Lab发布了一个预印纸概述了最初的CUT&RUN方案的改进,其中最重要的是使用了强洗涤剂来渗透细胞,而不是依赖于细胞核提取。他们报告说,这一变化提供了一个显著的改进和简化原来的技术,特别是在细胞或组织制备的初始步骤。

总之,CUT&RUN为ChIP-seq提供了一个很好的替代方案,特别是在收集大量细胞或需要高信噪比的情况下。它还结合现有的ChIP-seq数据集,提供了一个很好的额外的DNA结合位点测量,其中有许多现成的。基于我们实验室和其他实验室采用的CUT&RUN方法取得的成功,看来这项技术将很快成为与ChIP一样的标准方法。


非常感谢我们的客座博客,Matthew J. Niederhuber。

马修Niederhuber头像

马特·尼德胡伯(Matt Niederhuber)是北卡罗来纳大学教堂山分校(University of North Carolina in Chapel Hill)的一名研究生,他在那里研究增强剂和有关科学的博客。

额外的资源

  • 学习如何使用烦恼研究蛋白质相互作用
  • 了解其他类型的类型融合蛋白
  • 研究染色质相互作用捕获

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