用于生成IPSC的交付方法

诱导多能干细胞（IPSC）的领域已经存在10年。在那个时候，科学家们几乎使用了用于产生IPSC的所有可用方法。IPSC的生成在概念中相对简单：异常表达干细胞重编程因子的鸡尾酒，等待细胞去区分。然而，这很困难，特别是作为新手的重编程，决定使用哪种方法。这篇文章简要概述了重编程方法，目标是帮助读者选择适合他们研究的策略。

寻找干细胞研究质粒

表1：生成IPSCS的不同方法的关键特征。一个重要的说明:在这个表中，重编程效率的排名是基于报告的重编程效率González等人。没有列出百分比，因为许多变量(单元格类型、使用的标准等)会影响重编程率，这样的数字可能会引起误解。

集成IPSC交付方法

总的来说，有效地整合病毒载体，可靠地产生Ivwin668PSC，但它们有几个安全问题。首先，它们需要使用表达癌症的潜在有害的病毒颗粒，例如Myc。vwin668由于插入诱变的风险，病毒载体还具有IPSC产生方法的最大基因组足迹。随机集成还会产生异构的IPSC细胞系，这可以使线路之间的比较复杂化。转基因的不完全沉默是一个问题，并且在分化后，Myc或其他癌细胞的重新激活已与之相关肿瘤形成ipsc来源的和ipsc移植的小鼠。cree - deleteable或Tet-inducible慢病毒解决了其中的一些问题，但是整体整合病毒系统目前缺乏翻译使用所需的安全性。

vwin668

• 逆转录病毒：使用Moloney鼠白血病病毒（MMLV）的逆转录病毒产生了一些第一IPSC。逆转录病毒vwin668载体如pMXs或pMSCV，可以感染正在分裂的细胞，与其他传递方式相比，具有更高的生成诱导多能干细胞的效率。逆转录病毒具有~ 8kb的克隆能力，因此可以用一个多顺反子载体或多个单基因载体来包装重编程因子。重编程的一个重要里程碑是重编程转基因的沉默和相应的内源多能性基因的上调。逆转录病毒vwin668载体容易导致重编程基因的不完全沉默，从而导致不完全重编程。此外，在诱导多能干细胞来源的细胞中，病毒转基因基因的持续表达或重新表达会干扰其分化潜能。最后，逆转录病毒易于插入突变和随机整合造成iPSC克隆之间的变异。逆转录病毒临床应用不被认为是安全的。
• 慢动力：慢病毒载体vwin668感染分裂和非分裂的细胞，具有比其他逆转录病毒载体更大的克隆能力(8- 10kb)。vwin668这使得使用一个由一个启动子驱动的表达多个重编程因子的多顺反子盒成为可能。与mmlv衍生的逆转录病毒相比，慢病毒具有相似的重编程率，但重编程后，慢病毒并没有得到很好的抑制。这可以通过使用tet诱导病毒来控制重编程因子的表达来克服。查看文章末尾的链接，可以从Addgene获得tet诱导重编程载体的列表。另一个缺点是，慢病毒载体在每个转导细胞中插入不同的遗传位置，vwin668因此不可避免地存在克隆之间的异质性。这可能会使样品之间的比较复杂化，即转基因表达，因此重编程的程度可能会受到插入位置的影响。慢病毒插入也可以破坏肿瘤抑制基因和/或癌基因的表达，可能导致受感染细胞呈现癌样表型。与逆转录病毒一样，慢病毒传输被认为在临床应用中是不安全的。
  • 可割取的
    • Cre-lox慢病毒载体vwin668:该方法与使用标准慢病毒载体相同，但Cre重组酶的瞬时表达允许插入的loxP位点旁边的转基因基因的缺失。虽然在切除部位只有一个小的loxP疤痕，这种方法仍然被认为是不安全的治疗应用。
      
      
    • piggyBac (PB)转座子： 这PBrantposon.是一种移动遗传元件，通过载体和染色体DNA之间的“切割和糊”机制转移。PB具有〜9-14 kB的克隆能力。将该系统作为含有转座子的供体质粒转染到细胞中，以及表达转座酶的辅助质粒。供体质粒含有由末端重复序列侧翼的利益的基因，PB转座酶识别。在重编程之后，通过重新表达转座酶可以除去转基因。使用PB生成IPSC的挑战是，基因组改变可能在转座子插入位点发生，因此需要序列验证。

非整合IPSC递送方法

vwin668

• 腺病毒：腺病毒载体vwin668感染正在分裂和未分裂的细胞，具有~8kb的包装能力。有了这种包装能力，重编程因子可以作为一个单一的多顺反子转基因或与四种不同的腺病毒，每个腺病毒表达一个因子。这些载体不能整合到基因组中，而是由于细胞分裂而被稀释而丢失。这种方法的一个缺点是产生诱导多能干细胞的效率较低，通常比逆转录病毒低几个数量级;然而，由于它们不太可能引起插入突变，腺病毒载体被认为是表达重编程因子用于治疗的一种更安全的方式。vwin668
• 仙台病毒载体vwin668：仙台病毒是单股，负面意义RNA病毒。这是一个成员副黏液病毒科病毒科，还包括麻疹和腮腺炎。仙台转导多种细胞类型和复制细胞质独立于细胞周期。使用仙台病毒的一个挑战是，由于它具有复制能力，即使经过多次传代，也很难将病毒从所有细胞中清除。禁令等开发了一种温度敏感的仙海病毒，通过在38℃培养细胞除去，但筛选细胞的转基因仍然是一个重要的控制。此外，仙台病毒不依赖于转录调节的启动子，因此需要一种用于调节转基因表达的不同方法。查看萨诺等人了解microrna如何调控仙台病毒转基因表达。

短暂的重组交付

与集成方法相比，非集成方法具有更小的遗传足迹。这些方法消除了插入突变的风险，遗传伤疤的存在，和不完全沉默的转基因。总的来说，非整合方法比整合方法更安全，RNA和蛋白质传输被认为是最安全的，因为重编程因子的持续表达风险最小。

• Non-replicating
  
  • 质粒:产生具有基于质粒的表达的IPSCs需要连续转染1或2个质粒，表达感兴趣的重编程因子。这种方法的优点是实现的方法相对简单，不需要耗时的病毒产生。理论上这是一种非整合方法;但是，在实践中可以发生一体化。okita等人描述了一种通过质粒转染产生诱导多能干细胞的方法，11个克隆中有2个有质粒整合。另一个挑战是，多次转染使细胞在整个重编程过程中难以控制接收的质粒的剂量，当细胞积极分裂时质粒会更快地被稀释。转染的典型缺点仍然存在:转染效率依赖于细胞类型，较大的质粒转染率较低。
    
    
  • Minicircles:迷你圆就像迷你质粒。它们只包含一个真核启动子和要表达的cDNA(s)，它们不整合或复制。它们的小体积导致更高的转染效率，由于dna沉默机制的低活化，它们往往比传统质粒表达更长的时间。虽然小圆圈通常比传统的质粒要小，贾等人使用〜14.5kb minicircle生成的ipscs表达a二肽由OCT4，SOX2，LIN28，NANOG和GFP报告组组成的多排序盒。通过用每个细胞划分稀释来从细胞中取出细胞，但仍然可以完全移除Minicircle的几个段落。
• 复制
  
  • oriP/Epstein-Barr核抗原-1 (EBNA1)为基础的小片段：这些质粒携带复制（ORIP）元素的起源和来自Epstein-Barr病毒的CIS作用EBNA-1。EBNA-1结合orip并允许复制哺乳动物细胞中的质粒，并有助于将载体束缚到细胞的染色体中。随着选择标记的添加，该系统允许将ORIP / EBNA1质粒保持为稳定的粒状DNA。与其他方法相比，重编程效率较低。这可能是通过DNA甲基化对质粒的大尺寸或沉默的反映。使用EBNA1的载体的另一个缺点是，即使在除去选择后，质粒也可以悬挂一段时间。于等发现EBNA1诱导多能干细胞生成的亚克隆⅔仍存在偶联DNA。

DNA-Free方法

• RNA交付:对于这种方法，在体外使用阳离子载体连续转染转录的RNA。以下合成修饰用于保护RNA免受针对SSRNA的细胞防御：磷酸酶处理，用5-甲基胞苷的胞苷替代胞嘧啶，和/或用假尿苷代替尿苷。使用RNA重新编程单元的关键优势是它简单富有效率。与其他方法相比，它具有高效率的重编程，即使与集成病毒方法相比，也是如此。它也有很高的安全标记。

• 蛋白质递送：作为蛋白质的重编程因子是另一种避免将细胞暴露于外源遗传物质的方法。通过将它们融合给细胞递送至细胞，肽有助于介导其转导的肽，例如在中描述的polyarnine肽周等人和kim等人。这被认为是开发治疗应用的一种更安全的方法，但它可能需要很长时间来重新编程细胞。在Kim等人的实验中，细胞被暴露在重编程蛋白中，每周8小时，持续6周，仍然需要进一步培养以产生诱导多能干细胞集落。重编程效率也很低，而且很难纯化执行这些实验所需的重编程蛋白。

iPSCs特性分析

一旦产生了诱导多能干细胞克隆，就需要确定它们是如何表现干细胞样的。诱导多能干细胞通常首先用分子分析来测试。这些方法对多能性的评估不那么严格，但完成的时间也更短。形态学是一种简单、快速的评价方法。诱导多能干细胞应形成密集的集落，由细胞核大、核仁大、胞浆少的细胞组成。碱性磷酸酶阳性染色、胚胎蛋白表达、启动子去甲基化和内源性多能性基因(如Oct4)的表达是重编程的其他措施。如果使用逆转录病毒，那么沉默这个载体是成功重编程的另一个标志。

如果细胞含有重编程的分子标志，则通常以更严格的功能试验评估它们。细胞可以差异化在体外为了形成胚状体，该体是松散有组织组织的紧凑型球，其表达所有三种胚层（Ectoderm，Mesoderm，Endoderm）的标志物。测量小鼠细胞的多能递通常涉及通过将IPSC注入胚泡并将其注入雌性小鼠来制备嵌合体。产生嵌合后代显示IPSC对所有三种胚层的能力有助于所有三种胚层，并且Chimaeras产生All-IPSC衍生的后代的能力证明了IPSCs形成功能生殖细胞的能力。小鼠IPSC，四倍体互补的最高严格测试涉及用IPSCS注入四倍瓣胚泡并测量它们指导鼠标发展的能力。

由于人类IPSC不可能使用许多这些功能测试，因此生成畸胎瘤的能力是金标准。畸胎瘤形成需要将IPSC注入免疫缺陷小鼠，并寻找含有来自所有三种胚层细胞的肿瘤。

选择重编程方法

大多数IPSC研究分为两类：1）研究专注于更好地了解临床终点的重新编程和2）研究。在第一种情况下，IPSC的强大和高效生成是一个优先权，安全性较低。基因组整合较少令人担忧，因此病毒载体更适合这些情况。vwin668第二种情况需要更高的安全水平，并且尽可能少的基因组改变的机会，效率是权衡。非整合方法，例如eBisomes，RNA递送和蛋白质递送更适合这些类型的研究。重编程的细胞也将影响结果，因为并非所有细胞类型都很容易获得，或者易于重新编程。基本上，没有通用方法可以处理IPSC的所有应用，但应该至少有一种方法可以帮助您解决您的研究目标。

你是一个新的还是经验丰富的编辑器？您使用过哪种方法使用？让我们了解您的IPSCS在以下评论中的经历！

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方法从该参考文献调整数字。

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