滴式数字PCR用于AAV定量

由凯特哈顿德马奥

由于addgene开始产生AAV载体制剂,因此我们使用定量PCR来评估我们的准备的物理滴度。我们经常重复此测定以确认我们的结果是准确的。但是,如果我们能重复这项试验10,000次,以确保我们的赤度尽可能准确?这是液滴数字PCR(DDPCR)进入的地方。

定量PCR测定AAV滴度

在我们深入研究ddPCR之前,我们应该首先注意到定量PCR (qPCR)作为一种强大的AAV定量工具已经有一段时间了。当通过qpcr滴定aav,病毒DNA实时扩增和监测。当PCR完成时,通过将病毒DNA的阈值荧光与标准的阈值荧光进行比较来分析结果 - 通过已知量的DNA的一组反应。另外,AAV参考,具有已知滴度的病毒,可用于确认标准曲线正在准确读出样品

当然,如果QPCR是完美的,则不需要DDPCR。具有QPCR的一个问题是结果可以变化为2.这意味着如果您使用相同的样本设置两个相同的测定,则最终可能会使用4 x 10的滴度12基因组拷贝/mL或8 × 1012基因组拷贝/ ml和两个结果都有效。这就是为什么AAV参考是至关重要的原因。它允许您确定您的滴度是否在预期范围内。

我们还发现,qPCR标准曲线的生成很难正确。在Addgene,我们使用线性质粒标准。然而,即使标准制定正确,它也是不稳定的,在需要新的qPCR之前可能只适用于少量的qPCR。由于这些原因,我们正在将滴定法从qPCR过渡到ddPCR。

滴式数字PCR (ddPCR)不需要标准或参考,这意味着节省试剂(和时间)!

DDPCR板设置使用比QPCR板设置为量化AAV的井

滴式数字PCR测定AAV滴度

液滴数字PCR是利用水-油乳化技术将PCR反应混合物分成大约20,000滴。每个微滴都含有扩增目标DNA的成分。这种划分减少了每个反应的PCR抑制剂的数量,并允许增强产品的检测。作为一个额外的好处,复制被内置到技术中。一口井(包含数千滴)就足以捕获PCR实验所需的信息。

用ddPCR滴定AAV的过程从稀释病毒开始。值得注意的是,ddPCR每次反应的动态范围在1到100,000个基因组拷贝(GC)之间。因为AAV的滴度一般在10左右12到10.13气相色谱/毫升,你必须在将你的样本添加到mastermix之前连续稀释你的病毒。在Addgene,我们通常在ddPCR板上装载3份稀释剂。由于滴度未知,每次稀释都应在测定的范围内。我们通常将样品稀释1:60万至1:25万。

在制造稀释后,将它们转移到含有MasterMix的新板,其包括引物和DDPCR Supermix。请注意,您使用的SuperMix和液滴油应该来自同一制造商。否则,您最终会有差的液滴质量。

使用液滴发生器,样品和液滴生成的油通过小通道移动,形成含有约20,000液滴的油包水乳状液。每一个液滴都含有进行微型放大反应所需的物质。

清洁的ddPCR结果有明显的阳性和阴性飞沫的区别PCR完成后,液滴解读器从平板上提取液滴,并测量每个液滴的荧光振幅。荧光滴包含扩增的目标序列。读取所有液滴后,软件输出每个孔中每个液滴测量的荧光振幅图像(图2)。一个干净的ddPCR应该在阳性(蓝色)和阴性(灰色)液滴之间有明确的分离。无模板控制孔的阳性液滴应该很少。在右侧的图像中,在无模板对照孔中大约每微升有1个阳性副本。随着稀释度的增加,你也会注意到正滴数的减少。

ddPCR软件使用阳性与阴性液滴的比例来计算样品的浓度。这个浓度可以用来计算病毒滴度:

GC /毫升= {((R * C) (1000 / V)] * D}

R =反应体积

c =副本/ ul

V =反应混合物中病毒的体积

D =病毒稀释因子

大多数液滴读数器具有一些用于检测荧光的通道,使得可以同时测量多个靶的浓度。对于AAV滴定,您应该只需要使用一个。但是,两个通道可用于检查病毒基因组的完整性(Furuta-Hanawa等,2019年)。

执行ddPCR的提示和技巧

清洁一切

你必须有一个干净的工作区域来滴度你的AAV通过ddPCR。微滴数字PCR是一种敏感的检测方法,因此交叉污染到无模板对照(NTC)井是常见的。以下是你可以采取的一些步骤来实现一个干净的NTC:

  • 有一个专门的工作台和一套专门的移液管,用于ddPCR的设置。
  • 从准备样品稀释度的单独区域准备主混合。
  • 将所有试剂等分于单用管,并为每次设置抓住一个新鲜的试剂。
  • 用10%漂白剂擦拭工作台和所有消耗品。

吸管慢慢

如果您使用的是手动液滴生成器,则必须小心将液滴从液滴发生器转移到PCR板。保持高液滴计数对于计算样品的浓度非常重要。

即使您使用的是自动液滴发生器,在进行病毒稀释时也应避免移液太快。这将减少可能导致污染的气溶胶。

优化你的聚合酶链反应

关于PCR参数使用的一个好的起点,请参阅洛克关于AAV滴定的开创性论文(锁等,2014)。

如果您难以在使用这些参数的正负液滴之间获得干净的分离,这里有几件事您可以尝试:

  • 增加周期数。在额外回收的扩增后,您的荧光幅度将增加,导致正极和负液滴更大。建议不超过50个周期。
  • 降低爬坡速度。建议2C/s的速率,以确保所有液滴之间的温度变化均匀,但你可以降低到1C/s。
  • 将伸长时间增加至2分钟,并且已经显示出1分钟的变性时间增加液滴分离(Witte et al., 2016)。如果你的扩增子长度超过150个碱基对,这一点尤其重要。

当我们使用ddPCR进行AAV滴定时,该技术有很多应用。微滴数字PCR非常适合于低拷贝数的检测。因此,它可以用于罕见序列的检测和单细胞分析。它也被用于微生物的检测。一些应用程序包括测量可行的益生菌检测循环病原体

凭借其许多应用和易用性,液滴数字PCR正在成为PCR实验的流行选择。

下载病毒vectors 1vwin66801电子书


参考文献

Furuta-Hanawa, Birei, Teruhide Yamaguchi和Eriko Uchida。作为重组腺相关病毒载体的滴定和完整性评估工具的2D滴式数字PCR。vwin668人类基因治疗晶澳(2019)。PubMedPMID:31140327。公共医学中心PMCID:PMC6707039.

Gobert,Guillaume等。“液滴数码PCR改善了粪便样本中可行乳酸菌的绝对量化。”微生物学方法杂志148(2018):64-73。PubMedPMID: 29548643

锁,马丁,等。“通过液滴数量PCR”绝对测定单链和自拷贝腺相关病毒载体基因组滴度“。人类基因治疗方法25.2(2013):115-125。PubMedPMID:24328707。公共医学中心PMCID:PMC3991984

宋能等。用数字滴式PCR检测流行的结核分枝杆菌特异性DNA,用于受感染猴子的疫苗评估和结核病诊断新出现的微生物和感染7.1(2018):1-9。PubMedPMID:29691363。公共医学中心PMCID: PMC5915492

Witte, Anna Kristina等。影响单核增生李斯特菌prfA检测中滴雨参数的系统调查-减少ddPCR中不明确的结果。《公共科学图书馆•综合》11.12(2016):E0168179。PubMedPMID:27992475.。公共医学中心PMCID: PMC5167268

addgene博客上的其他资源vwin.com mobile

addgene.org的资源

主题:vwin668,病毒矢量协议和提示,AAV

发表评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅