通过PCRI缓解蛋白质纯化过程

由玛丽传动装置

玛丽传动
科学家受到蛋白质纯化的沮丧

蛋白质纯化可以是最紧张的实验室活动之一。与蛋白质一起使用需要大量的适当折叠,相对纯蛋白质的量,但到达这个阶段通常更容易完成。在我们的审核中质粒101系列,蛋白质从质粒构建体过表达,最常是特殊的大肠杆菌设计用于蛋白质表达的菌株。然后裂解培养物,利用蛋白质纯化亲和力标记。额外标签可用于改善蛋白质稳定性和溶解度。

确定表达一个人的蛋白质的最佳方式可以节省大量时间。蛋白质净化专家建议进行一些研究,特别是测定亚细胞定位和蛋白质中的二硫键数 - 两种参数影响如何大肠杆菌可以产生你的蛋白质。许多蛋白质的结构信息易于访问RCSB蛋白质数据库pdbsum.。获取此信息后,您可以选择表达式向量和表达式系统。如果发现您的蛋白质可能不会折叠,则应筛选一些不同的载体,以查看它给您最常用的蛋白质。

PCRI系统,最近沉积在addgene上F. Xavier Gomis-rüth,旨在通过简单高效的多路复用将猜测从蛋白质纯化中净化。将PCRI质粒分为两组,每个组包括具有不同品种标签的质粒,包括N-和C末端。每组质粒使用相同的限制酶用于克隆(参见下文示意图),使研究人员能够快速且容易地测试一种蛋白质的多个标签。这些标记的质粒还包括裂解位点,应该需要去除纯化后的标签。

用于蛋白质纯化的PCRI构建体的元素:6xHIS标签使用Ni-NTA树脂实现亲和纯化。麦芽糖结合蛋白(MBP)改善了蛋白质溶解度和稳定性。硫昔林A(TRX)和信号肽标签有助于用二硫键折叠蛋白质。如果存在TEV蛋白酶位点,TEV可以从纯化的蛋白质中除去这些标签。

PCRI构建体样品:PCRI-1A,-4A和-9A。6xHIS标签使用Ni-NTA树脂启用亲和纯化。MBP改善蛋白质溶解度和稳定性。TRX和信号肽标签有助于用二硫键折叠蛋白质。如果存在TEV蛋白酶位点,TEV可以从纯化的蛋白质中除去这些标签。有关PCRI系统中使用的这些和其他标签的更多详细信息,请参阅质粒101:蛋白质标签

超过大肠杆菌净化枯草芽孢杆菌Pichia Pastoris.

PCRI还包括专为蛋白质表达而设计的质粒,除了大肠杆菌,特别是细菌枯草芽孢杆菌和酵母Pichia Pastoris。这些微生物的改善的分泌能力使它们可用于产生难以折叠的蛋白质。此外,P. Pastoris.具有糖基酯蛋白的能力,可以重新承载在其他真核生物中加入的蛋白质中加入的翻译后修饰大肠杆菌。为这些系统设计的质粒可包括信号肽(SP),其通过分泌途径将蛋白质排出以改善折叠和二硫键形成。如果一个人喜欢表达大肠杆菌,使用硫昔林A(TRX)甲瘤载体可以改善二硫键形成。

PCRI还包括难以纯化膜蛋白的特殊特征。PCRI矢量PCRI-13A,专为使用而设计B.枯草芽孢杆菌,包含Mistic(积分膜蛋白构建体翻译的膜整合序列)蛋白标签。Mistic将标记的蛋白质拖入膜中,并可改善本身定位在那里的蛋白质的表达。

PCRI既多功能又易于使用,我们希望将一些压力取出蛋白质纯化。有关PCRI更全面的介绍,请参阅下面引用的原始出版物。PCRI质粒也可用单独或者作为A.从addgene完成套件

参考

1. Goulas,Theodoros等。“PCRI系统:重组蛋白表达和纯化的矢量集合。”普罗斯一体9.11(2014):E112643。PubMed.PMID:25386923。pmed中央PMCID:PMC4227841

年轻,Carissa L.,Zachary T. Britton和Anne S. Robinson。“重组蛋白表达和纯化:对亲和标签和微生物应用的综合审查。”生物技术杂志7.5(2012):620-634。PubMed.PMID:22442034

额外资源

addgene博客上的资源vwin.com mobile
addgene.org的资源

建议储存库的质粒

话题:www.vw033.com 质粒

发表评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅