最初发布于2016年10月11日，最后由Benoit Giquel于2020年12月22日更新。
克里普尔克由于其易于使用和在各种各样的生物体中使用，已经在基因组工程世界掀起了风暴。虽然目前的大部分CRISPR研究集中于其在人类医学上的潜在应用(华尔兹，2016)，但CRISPR的潜力植物基因组工程也在实现。有多种原因需要考虑使用基因组编辑来改变植物的遗传码，包括庄稼的发展，保质期更长以及抗病作物的发展增加农业收益率（Wang等，2016; Wang等，2014）。虽然使用传统的植物育种方法当然可以选择理想的性状，但这些技术是繁琐的，通常需要几轮的选择来分离感兴趣的表型。另一方面，基因组工程允许对调控理想表型的已知或可疑基因进行定向修饰。事实上，CRISPR已经被用于设计许多植物物种的基因组，包括常用的模式生物，如拟南芥和苜蓿，以及一些作物物种，包括土豆、玉米、番茄、小麦、蘑菇和水稻(Khatodia et al.， 2016)。尽管在大多数生物中，尽管克里普尔系统的几乎普遍功能，但有些植物特异性变化对CRISPR组件有必要使植物细胞中的基因组进行。
本博客帖子将概述植物基因组工程的概述使用CRISPR，突出了对CRISPR机械的具体修改，允许在植物中使用CRISPR，并概述来自Addgene的学术研究人员可用的各种植物基因组工程工具。
植物基因组工程的CRISPR组件
CRISPR可用于敲除、激活或抑制植物中的靶基因，其原理与在其他模式生物中开发的一般实验设计原则相同(见我们的CRISPR指南为了常见的Crispr Priciple）。然而，对常用的CRISPR质粒的植物特异性修饰是在植物细胞中使用CRISPR系统是必要的。与其他模型系统一样，表达链球菌Cas9或Cas9变体（以下称为Cas9）和单链导向RNA（GRNA）足以改变植物细胞的基因组。GRNA的结构（由〜20核苷酸靶向序列和〜75个核苷酸支架序列组成）在植物和其他生物之间一致，但用于驱动GRNA表达的启动子取决于所讨论的细胞类型。在植物细胞中，通过将植物特异性RNA POL III启动子下游的GRNA放置在植物特异性的RNA POL III启动子，例如ATU6，TAU6，OSU6或OSU3中来实现GRNA表达，其通常用于在其各自物种中驱动小RNA的表达。addgene携带> 30“空的grna”骨干它含有植物POL III启动子和GRNA支架序列，并允许研究人员以最小的克隆需要靶向寡核苷酸。与其他模型系统一样，可以表达多个GRNA以一次性修改若干基因组基因座（获取有关多路复用GRNA的更多信息)。
CAS9通常用核定位序列标记，以增强靶向核，并且已经创建了几种密码子优化的CAS9变体，以增加特定植物物种或细胞类型（Belhaj等，2013)。核酸酶死Cas9（DCAS9）的活化剂（例如DCAS9-VP64）或阻遏物（DCAS9-Krab或DCAS9-SRDX）也可用于分别在植物细胞中激活或压制靶基因。Cas9表达通常由植物衍生的RNA POL II启动子驱动，其调节较长RNA的表达（例如用于基因表达的MRNA）。Cas9表达的常用RNA POL II启动子的实例包括普遍地表达植物油瘤瘤病毒35s启动子（CAMV 35s）或泛素启动子（Belhaj等，2013）。Addgene携带cas9基因敲除质粒，激活和抑制在植物和许多上述的目标基因空的grna backbones还包含CAS9，其能够表达CAS9和相同质粒的GRNA。
将CRISPR组件传送到植物细胞
一旦您为您的应用程序选择了正确的CRISPR组件，就该将这些组件交付给目标细胞了。请记住，有效地传递CRISPR组件对于任何CRISPR实验都是必不可少的，如果在你的细胞系中表达gRNA或Cas9失败将导致实验失败。CRISPR成分可以稳定或瞬时表达，这取决于传递方法和细胞类型。CRISPR组件可以使用标准的洗涤剂聚乙二醇(PEG)瞬时表达，尽管这种方法的应用仅限于原生质体细胞(细胞壁被去除的植物细胞)。另一种常见的递送方法是农杆菌介导的递送,哪一种使用土壤衍生的细菌一个grobacterium农作为一种携带感兴趣的基因进入靶细胞系或生物的载体（如图1所示）。更多信息农杆菌属介导的转换可以在其中找到博客。这PDGE DICOT基因组编辑套件来自Stuttmann实验室包含多种Agrobacterium-compatible，Cas9包含载体，准备好用于金门的介导克隆您的兴趣的GRNA。
近年来,deaminase-mediated基本编辑（胞嘧啶基础编辑器或腺嘌呤基础编辑器）和逆转录酶介导'编辑技术人员已被证明是优异的替代基因组编辑技术，特别是在人体细胞中。与此相反同源性定向修复，这些方法不涉及双链断裂（DSB）形成，不需要供体DNA，。这些精确的编辑往往比HDR更有效（Zhu等人，2019年回顾)。胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器均已问世为工厂开发的和植物的素质编辑已经存在开发了米饭由Yiping Qi的实验室和对于大米和小麦由CIXIA GAO的实验室。
最近开发的方法还可用于有效地将CRISPR-CAS9组件提供给植物。纳米粒子（碳纳米管，Kwak等，2019），DNA纳米结构（Zhang等，2019）或细胞穿透肽（Santana等，2020）和植物病毒（大麦黄色条纹叶片病毒（Gao等人。,2019) or sonchus yellow net rhabdovirus (Ma et al., 2020) have already been shown to be efficient ways to deliver CRISPR-Cas9 to plant cells and should be considered alternative to PEG or agrobacterium-mediated delivery.
概括
虽然许多具体的细节 - 使用，精确的蛋白质序列或域，以及递送方法 - 植物中Crispr介导的基因组工程的潜在技术并非如此与其他系统中使用的全部不同。幸运的是，您不必远视靶向您最喜欢的植物基因所需的植物特异性修饰的质粒;您可以在植物中找到许多用于各种CRISPR应用的质粒可通过addgene获得。除了上述质粒外，加入还具有几种有用的脆性工具包，用于产生植物表达质粒，包括植物CRISPR来自Yiping Qi Lab的质粒和MoClo植物部件套件Patron实验室的与存储库中的所有质粒一样，我们强烈建议您阅读相关的出版物或协议，以最大限度地利用您为实验选择的质粒，但是，如果您是与植物一起工作的，不要害怕尝试您的手在CRISPR。
参考
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