扩展腺嘌呤基础编辑器的目标范围和编辑效率

由Susanna Bachle.

大卫刘的实验室创造了第一个基本编辑器2016年(Komor等,2016年),从那时起一直试图扩展他们的精确编辑能力。基础编辑器使特异性DNA碱变为变化,并由融合到DNA改性酶的催化受损的CAS蛋白(DCA或CAS酸酐),在这种情况下是脱氨酶。来自C•G-TO-T•A的基础变化由胞嘧啶基础编辑器(CBE)介导,并且来自A•T-To-G•C的基础变化由Adenine基础编辑器(ABES)介绍。这是如何运作的?通过分子生物学团队合作。引导RNA(GRNA)指定DNA上的编辑靶位点,CAS结构域将改性酶引导至靶部位,并且脱氨酶诱导DNA碱的变化,而无DNA双链断裂。但基础编辑并不完美。它们可能很慢,只能瞄准某些网站,或者只制作基替代的子集。

需要速度:CAS之前的基本编辑让我们走

大卫刘举行了谈论基本编辑和素数编辑
图1:大卫刘举行了细胞讨论会的谈话:基于细胞和基于细胞的疗法:Crispr,干细胞,本月早些时候会议。

为基础编辑器产生的另一个问题是编辑域必须在CAS域放开DNA之前诱导基本变化。ABES有些缓慢并且需要强大的CAS9域以“保持”足以使DNA诱导基础变化。因此,ABES仅与SPCAS9之外的许多CAS域略微兼容。为了扩展基因编辑应用和eBES的靶向范围大卫刘的实验室阐述了对CAS同源物的兼容性增加的Apes。

在噬菌体的帮助下发展更好的基础编辑器!

来自刘实验室的最新ABE是ABE7.10它含有脱氧腺苷脱氨素酶,TADA-7.10(Gaudelli等,2017)。这个想法是为了演化达达-7.10版本,脱胺率较快,以便在CAS同源物放开之前,可以发生脱胺。刘实验室开发了噬菌体辅助连续演进(速度)和噬菌体辅助的非连续演进(PANCE)选择系统,更好,更快的APES(图2)。这些系统允许通过许多突变,选择和每天复制来快速连续蛋白质演进。

速度和PANCE系统使用M13噬菌体,依赖于基因III的表达来产生传染性颗粒。细菌中基于质粒的基于质粒遗传循环将GENE III的表达与基础编辑器活动和编辑速度的表达联系起来,包括以下组件:

  • 表达DCAS9的宿主细菌中的质粒
  • 表达基因III的宿主细菌中的质粒。基因III在T7 RNA聚合酶的控制下,不能表达,直到碱基编辑器校正T7 RNAP内的早期止血密码子。
  • 编码脱氨酶TADA-7.10的噬菌体
  • 控制噬菌体突变率的诱变质粒

噬菌体感染导致完整的ABE蛋白质。如果噬菌体提供基本编辑器的活性变体,则产生功能基因III产物,并且可以感染细菌细胞。如果噬菌体不提供活性变体,则噬菌体不传染。编辑速度决定哪种噬菌体变体可以比稀释速率更快地传播(从感染至新鲜的未感染的宿主细胞培养的通过通道)。该稀释步骤代表了速度和PANCE之间的主要差异:对于PANCE,噬菌体后代未稀释,但是从受感染的宿主细胞培养物手动被传递给未感染的培养物,导致整体稀释且严格的噬菌体选择较少。

噬菌体辅助演化的工作流程的基础编辑活动
图2:噬菌体辅助演化的基础编辑活动。细菌中基于质粒基遗传循环将基因III的表达与基础编辑活动和编辑速度的表达联系起来。

介绍ABE8E - 快速灵活的adenine基础编辑器

低严格的PANCE,之后是较高的严格速度,导致与原始TADA-7.10酶相比具有更高的基础编辑活性的TADA变体的演变。在测试众多TADA变体后,它们识别了TADA-8E,其比TADA-7.10更快地编辑590倍。它与所有CAS9和CAS12同源物兼容,研究人员在包括SPCAS9,SACAS9,LBCAS12A,ENASCA12A,SPCAS9-NG,SACAS9-KKH,CP1028-SPCAS9和CP1041-SPCAS9。这生成的基础编辑器被命名为abe8e。ABE8E不仅快速,它也可以复用:当任务纠正妨碍胎儿血红蛋白基因表达的两点突变时,ABE8E同时变化,效率为54%,比abe7.10高约7倍。

然而,ABE8E的增加的编辑速度和靶向范围具有代价:ABE8E显示出越靶DNA和偏离靶标RNA活性。为了缓解该缺点,实验室将额外的突变(V106W)引入TADA-8E,并得到的ABE8E(TADA-8E V106W)在靶DNA上作为ABE8e的较高,同时保持下靶DNA和关闭目标RNA编辑ABE7.10的编辑率。

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为什么工程师和优化基础编辑器?

天然存在的酶和功能域的有针对性的演变加速了能够进行先前无可认定的序列的更快更精确的基础编辑器的开发。四个DNA碱基渗透,所以称为C至T,G至A,A至G和T至C的点突变代表了约三分之二的已知致病点突变。在一起,胞嘧啶和腺嘌呤基础编辑器可以纠正所有四种点突变,理论上将疾病相关版本转化为野生型版本。随着ABE8E的添加到基本编辑工具箱,科学家现在可以更有效地制作这些编辑,并在更多的环境中更高。

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参考

Gaudelli NM,Komor Ac,Rees Ha,Packer Ms,Badran Ah,Bryson di,Liu Dri(2017)在没有DNA裂解的基因组DNA中的A•T至G•C的可编程基础编辑。自然551:464-471。https://doi.org/10.1038/nature24644

Richter Mf,Zhao Kt,Eton E,Lapinaite A,Newby Ga,Thuronyi BW,Wilson C,Koblan LW,Zeng J,Bauer de,Doudna Ja,Liu Dr(2020)噬菌体基础编辑器的噬菌体辅助演进与改进的CAS域兼容性和活动。自然生物技术。https://doi.org/10.1038/s41587-020-0453-z.

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