FLEx技术和光遗传学:通过高时空分辨率打开基因表达的开关

客人的博客

这篇职位由Alessia Armezzani,科学传播经理在基因尼州。

几十年前,大脑仍然难以实现,而不是科学家缺乏智慧的好奇心,而是从有限的技术中获得。然而,在过去的几年里,卓越的技术进步已经将研究人员带到现代神经科学中革命的门槛,这是一种技术的时代柔性光遗传学会面,允许科学家探讨脑功能和功能障碍的基础。

首先,让我们从基础开始:什么是光遗传学?

Optimetics:用光控制神经元

2005年,由神经生理学家领导的斯坦福大学的团队Karl Deisseroth.,结合光学和遗传方法光刺激哺乳动物的神经元并改变突触事件:一项新的技术诞生了,并创造了术语“光遗传学”(Boyden et al., 2005;deisserth等人,2006)。

尽管光遗传学的发展相对较晚,但它的历史始于近50年前发现的微生物视紫红素,这是一种吸收光子进行能量转换或诱导细胞内或细胞间信号通路的光敏蛋白(Ernst et al., 2014)。微生物视紫质是由视蛋白基因编码的,包括细菌视紫质,盐视紫质和通道视紫质,前两种在archaea.(Oesterhelt和Stoeckenius, 1971;Matsuno-Yagi和Mukohata, 1977;福斯特等人,1984年;Harz和Hegemann, 1991)。这些蛋白质控制细胞膜电荷的流动,并在可见光下维持膜电位(Zhang et al., 2011)。

微生物紫红蛋白酶和神经元有什么共同之处?神经元刺激通过离子穿过轴突的膜的运动来触发:一旦一定数量的正离子穿过细胞膜,达到阈值并发射神经元,向下发送电信号(Lodish等,2000)。大脑中大多数神经元都不是自然的光敏,因此靶细胞中OPSIN基因的选择性表达使得可以控制具有比可以使用药理学或电生理方法(Deisseroth,2011的Deisseroth)可以实现的特异性的神经元活动(Deisseroth,2011年;梅和张,2012; Towne等人。,2016)。

光学性神经调节是通过光的:当用正确的波长击中时,微生物瓦多摩斯使离子能够穿过轴突的膜,从而控制神经活动(Bernstein和Boyden,2011; Mei和Zhang,2012)。例如,蓝光激活渠道和刺激性植物,反过来触发神经激发,而黄光激活Halorhodopsins沉默神经元活动(图1)(Wiegert等,2017)。

光遗传通道视紫质和盐视紫质控制神经元放电

如何让视蛋白进入大脑

为了表达大脑内的Opsins,研究人员将遗传修饰的病毒注射将微生物紫红蛋白酶编码成特定的脑区。随后通过直接植入注射部位并连接到激光器的纤维套管进行光刺激的病毒感染神经元。激光闪烁特定波长的光,选择性地打开或关闭神经元活动(Atasoy等,2008; Taylor等,2016; Hooper和Maguire,2016)。

重组腺相关病毒(raav)由于其相对稳定的染色体外长期表达和诱导先天免疫反应的能力较低,在中枢神经系统的基因传递中越来越受欢迎(Fenno et al., 2011)。然而,raav缺乏特异性感染已定义神经元亚群的能力,这是光遗传学的一个主要缺陷(Belzung et al., 2014)。这可以通过将视蛋白基因与细胞型特异性启动子融合来克服;然而,这些通常驱动下游基因的弱表达。另一方面,强细胞特异性启动子对于raav来说太长,只能封装小于5kb的序列(Hirsch et al., 2016;Hudry和Vandenberghe, 2019)。那么如何在特定的神经元细胞中实现强的视蛋白表达呢?这就是FLEx进入场景的地方。

FLEx:当夜幕降临的时候,一盏灯!

FLEx(用于翻转切割)开关(又名戴奥(D.ouble-floxed一世nverseO.)或DO (D.ouble-floxedO.rientiation))是一种强大的工具,可提供基因表达的精确时间和空间控制在活的有机体内(Schnütgen等,2003)。这是通过特异性特异性重组酶实现的,例如CreFLP.在定义的识别位点诱导DNA重组(即,熏鲑鱼P和FRT,分别)(Abremski和Hoess, 1984;凡·达因2001;克里斯滕森维克和克罗克马格努森,2018年)。

致光学弯曲载体含有对报告基因(例如,MCHERRY)融合的OPSIN基因(例如,通道流蛋白-2,CHR2)上游的强启动子以容易地检测表达OPSIN的细胞。得到的融合基因相对于启动子以反义取向插入以防止其表达,并通过两组不相容的识别位点(例如,“氟化”)(例如,“氟化”)(例如,熏鲑鱼P和熏鲑鱼在相反的方向。由于Cre不引起不匹配的识别位点之间的重组,它的存在首先引起视蛋白倒置,然后熏鲑鱼站点切除,因此将OPSIN锁定为要转录的正确方向(图2)(Sharma和Zhu,2014)。

FLEx是如何在特定的神经元细胞中实现强烈的视蛋白表达的?这可以通过使用Cre依赖病毒来实现,例如与转基因动物结合的光遗传FLEx载体或在特定细胞型启动子下表达Cre的raav。一旦被注射进大脑,这些病毒就会感染所有不活跃的视蛋白基因的细胞;然而,在表达Cre的细胞中,Cre诱导双流式视蛋白结构的重组,从而使其仅在特定的神经元细胞中在强启动子下表达。因此,FLEx确保了空间准确性和强视蛋白表达,这两者在光遗传学研究生理和行为过程中都是必不可少的(Abdallah et al., 2018;Deubner等人,2019年)。

Flex Switch策略

例如,泰勒和同事使用了基于RAAV Flex的向量,以研究睡眠和麻醉机制背后的神经电路。在CRE转基因小鼠中,它们靶向脑的腹侧腹部区域(VTA)的多巴胺(DA)神经元。特别地,他们发现DA神经元的致灭刺激产生了以前经受稳态通用麻醉的小鼠中唤醒的行为和脑电图证据(Taylor等,2016)。

这些神经元也在动机行为中扮演着核心角色(Juarez和Han, 2016)。然而,就在不久前,我们还完全不清楚DA神经元的哪个亚群能够激活食欲刺激,而不是厌恶刺激。在最近的一篇论文中,de Jong和他的同事使用基于rAAV flex的载体来回答这个问题,绘制并表征了腹侧静脉区的DA神经元的活动。使用在活的有机体内致光学刺激,它们同时记录了该脑面积的离散群的电脉冲,证明可以将神经元输入分离以诱导厌恶或奖励相关的行为。弯曲载体的高时空精度和可逆调制结合使用靶向不同脑区域的几个CRE转基因小鼠的使用使得具有与动机行为相关的脑区域的神经电路架构的详细和功能性地形(de Jong等等。,2019)。因此,Flex矢量是光学机构的理想伴侣,以了解脑的细胞和分子机制在活的有机体内

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非常感谢我们的访客博主Alessia Armezzani从基因尼。

Alessia-Armezzani.Alessia Armezzani从格拉斯哥大学获得病毒学的博士学位。然后,她搬到了法国,在那里她曾担任ÉcoleMongaleSupérieuredeLyon的发博博士学生博士学位。她对教育科学的热爱导致她追求教学职业生涯,现在她是一个非常幸福的科学传播经理genOway

确认:
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参考文献

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