FlipGFP是一种研究细胞凋亡的新型荧光蛋白酶

由Alyssa Cecchetelli

细胞凋亡或“程序性细胞死亡”在包括发育、免疫系统和细胞周转在内的一系列生物过程中起着关键作用。细胞凋亡是一个高度受控的过程,由发育线索和DNA损伤等内外信号触发。这些信号激活了caspases的级联反应,caspases是一种分解蛋白质的蛋白酶。刽子手caspases是级联反应中最后被激活的,它导致600多个细胞成分的降解,最终导致细胞破碎和死亡(爱尔摩,2007)。

研究细胞凋亡在活的有机体内,科学家已经使用基因编码荧光刽子手caspase报告。一些凋亡报告基因已经被开发出来,例如福斯特共振能量转移(FRET)基于刽子手caspase记者。在这些报告基因中,FRET对通过caspase裂解位点连接。用caspase切割连接体导致荧光发射的变化。然而,FRET和荧光法的报告基因有一些局限性。首先,由于蛋白水解后供体和受体的荧光变化很小,FRET信号往往难以检测,因而难以量化其次,由于组织自身荧光、细胞异质性和/或细胞位置变化等问题,生物体的荧光成像具有挑战性(等人,2016年,张等人,2019)。从而有效地研究细胞凋亡在活的有机体内科学家需要一种具有大动态范围和高亮度的蛋白酶报告剂。

蜀实验室加州大学旧金山分校设计了一种改进的细胞凋亡报告程序,ZipGFP,利用自组装分裂的GFP (GFP1-10和GFP11)在蛋白酶活性(等人,2016年)。然而,该实验室想要增加荧光范围,以更好地研究活动物凋亡的时空动态。为了做到这一点,他们通过翻转一个单一的GFP β链来修饰一个不同的自组装分裂GFP (GFP1-9和GFP10-11),因此命名为FlipGFP。与其他报告基因相比,FlipGFP增加了100倍的荧光(张等人,2019)。

FlipGFP是如何工作的?

GFP包含11条β链和一个中心ɑ-螺旋,可分为3部分:(1)β1-9链(β1-9)和一个ɑ-螺旋,(2)β10链(β10)和(3)β11链(β11)。每个部分都含有荧光所必需的成分和残留物。当这些部分相互分离时,蛋白质不能发出荧光。当β10和β11连接在一起,但从β1-9分离时,它们会与附近的β1-9链迅速重组,在几十分钟内产生荧光(Cabantous等人,2013)。

舒实验室利用了这一点,提出了一个荧光依赖于蛋白酶激活的系统。β10-11通常是反平行的。为了防止结合,FlipGFP中的β链被重新设计,使它们彼此平行,从而不再适合于β1-9。他们将β10-11与两个连接体(E5和K5)连接在一起,使其二聚并形成平行构象。在β11和其中一个连接体之间是一个caspase-3(一个刽子手caspase)切割位点(DEVD)。在序列切割后,β10和β11可以重新排列到它们的正常反平行位置并发出荧光。

FlipGFP caspase报告基因示意图

FlipCherry:红色荧光蛋白酶报告物

为了增加荧光报告物工具包,Shu实验室还设计了一个基于超级文件夹Cherry (sfCherry)的红色荧光蛋白酶报告物。与FlipGFP一样,sfCherry被分裂为β1-9和β10-11,其中β10-11被连接到TEV蛋白酶裂解位点的E5和K5连接体强迫成平行构象。TEV蛋白酶是一种高特异性的蛋白酶,常用来切割蛋白质。然而,这个基于sfCherry的蛋白酶报告物最初并没有在HEK293细胞中发出荧光。为了纠正这一点,Shu实验室首先通过定向进化将sfCherry的自组装能力提高了约20倍。然后他们优化了这两个连接的长度,以生成一个会发出荧光的报告者:FlipCherry。FlipCherry提供了一个概念的证明,即FlipGFP中使用的设计可应用于其他荧光蛋白,以创建一个多色报告基因阵列,从而能够同时成像多个蛋白酶(Zhang等人,2019)。vwin德赢娱乐平台

研究细胞凋亡在活的有机体内使用基于flipgf的caspase报告基因

Shu实验室成功地利用FlipGFP研究了HeLa细胞、斑马鱼胚胎和果蝇。他们用staurosporine处理表达FlipGFP的HeLa细胞,staurosporine通过激活caspase-3诱导细胞凋亡,并在2 ~ 5小时内检测荧光,时间与之前的方法一致。在斑马鱼中,Shu实验室使用FlipGFP追踪胚胎发育过程中细胞凋亡的时空动态。GFP荧光随时间增加,并在发育中的前脑和视网膜中显示出清晰的模式。这与TUNEL染色一致,TUNEL染色是观察凋亡细胞的常用方法。最后,Shu实验室证实了基于flipgpf的caspase报告基因可以用于观察中肠上皮细胞的凋亡果蝇,到目前为止,这一观察一直很困难(Zhang等人,2019)。

结论

FlipGFP是一种动态范围大、亮度高的新型荧光报告基因。该报告作者在用刽子手caspase切割后获得了大约100倍的荧光增加。细胞死亡失败或细胞在错误的时间和/或地点死亡会导致一系列疾病和病理,如神经退行性疾病、自身免疫性疾病和癌症(Elmore, 2007)。本报告将允许科学家同时观察细胞凋亡的时空动态在体外更好地研究和理解这些疾病和紊乱。

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参考文献

Cabantous, Stéphanie,等。“一种新的基于三部分分裂-绿色荧光蛋白关联的蛋白质-蛋白质相互作用传感器。”科学报告3(2013): 2854。PubMedPMID:24092409。公共医学中心PMCID:PMC3790201

爱尔摩,苏珊。凋亡:细胞程序性死亡综述毒物学的病理35.4(2007): 495 - 516。PubMedPMID:17562483。公共医学中心PMCID:PMC2117903

杜志良等。基于gpf的荧光caspase报告基因在体内成像凋亡的合理设计细胞化学生物学23.7(2016):875-882。PubMedPMID:27447051。公共医学中心PMCID:PMC5026494

张强,等。“通过翻转GFP的β链来设计一种绿色荧光蛋白酶报告物来成像动物的凋亡。”美国化学学会杂志(2019)。PubMedPMID:30821975

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