哪种荧光显微镜技术最适合我?

由Guest Blogger.

本文由哈佛大学生物成像中心主任、哈佛大学分子和细胞生物学讲师道格·理查森撰稿。

无论您是超级碗的体育摄影师,医疗技术专家都采用X射线,或生物学家成像最小的生物结构;伟大形象的关键是对比。人类视觉系统主要依赖于对比度来识别各个物体并在我们周围的世界中感知世界。没有对比,物体只是噪音。

由于其无与伦比的对比度,荧光成像作为现代生物学中的主要光学显微镜对比技术(1)。当正确执行时,荧光显微镜提供高对比度图像,其中亮信号覆盖完全黑色的背景。除此之外,使用多个荧光团可以为图像添加第二层对比,即颜色对比,从而为观者提供分子或结构上的特异性。最后,现代显微镜设计可能进一步利用荧光团的独特特性来阻止聚焦荧光到达探测器,或将荧光限制在特定的激发体积以增强空间对比度(即光学切片(2)或超级分辨率(3.)。

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荧光显微技术

光学部分VS超分辨率显微镜

荧光宽场显微镜

荧光广角显微镜是荧光显微镜最常见和最简单的形式。准直(不会聚或发散)激发光退出显微镜物镜均匀地照亮整个(宽)视野。向物镜反射的荧光灯被收集并聚焦到照相机上,以实现可视化。以与荧光采集相反的方向照亮样品被称为“Epi”照明。因此,它们有时被称为外荧光显微镜。(见上图左图)。

点扫描共聚焦显微镜

点扫描共聚焦显微镜是结合光学切片的第一荧光显微镜技术。光学切片是指从相对较厚的三维样本内从单个薄平面中提取光的能力(参见图1);类似于MRI或CT扫描仪。这是通过将激励光聚焦到样品中的一个点来实现光栅扫描通过像素构建最终图像像素的点。在到达探测器之前,收集的荧光灯通过针孔。针孔特别放置,仅允许来自焦平面的光到达检测器,并且排除从上方或下方的所有光。

并行化共聚焦显微镜(纺丝盘)

平行共聚焦显微镜(旋转盘)增加速度,在其中一个共聚焦图像可以获得。一个像素一个像素地组装图像是缓慢的;因此,某些共聚焦显微镜使用平行化来提高性能。在旋转盘式显微镜中,一个包含若干孔洞的金属盘通过激发光路径旋转。每个孔对应于样品中的不同位置。由于一次有多个孔洞被照亮,图像可以更快地获得。

2-光子显微镜

2-光子显微镜试图解决两个宽场和共聚焦显微镜的缺点。首先,宽野外和共聚焦显微镜将励磁光通过整个轴向体积的样品。因此,当在整个样品中获取大量光学切片时,所有样品中的所有荧光团都不断地暴露于光,而不仅仅是焦体积中的荧光团。这导致更快光佛和信号强度的降低。2-光子显微镜将激励(和漂白)限制为单个焦点。这是通过使用例如红光而不是蓝色来实现的,以激发分子GFP.。因为红光具有大约蓝光能量的一半,所以与蓝色中的一个相比,需要两张红光来激发GFP。只有在目标的焦点只能在足够高的红色密度的红光子的情况下建立这种情况。

使用红灯具有第二个优点:红灯深入渗透到生物组织中。为了证明这一点,只需将闪光灯握住闪光灯到手掌上。虽然白光正在进入手,但只能看到橙色/红光通过组织。因此,2-光子允许更深的成像进入厚组织。

灯纸显微镜

灯纸显微镜通常利用两个或多个物镜的配置来创建与收集荧光的成像物镜垂直传播的激发光薄片。就像双光子显微镜一样,一次只能激发样品的一个单焦平面,限制了光漂白。与宽视场类似,整个视场在同一时间被激发,并在单台相机曝光中被捕获。这比在共聚焦显微镜或双光子显微镜中依靠光栅扫描要快得多。

全内反射显微镜(TIRF)

全内反射显微镜(Tirf)是一种用于仅激励坐在盖玻片旁边的非常薄的荧光分子层的技术。光以一定角度通过盖玻片突出,使得当它到达玻璃盖玻片之间的界面和水性缓冲液中的样品时,它完全反射。由于玻璃和水样缓冲液之间的折射率不匹配而发生这种反射,样品浸入其中。虽然激发光完全反射,但通过玻璃被完全反射,能量通过释放能量传播到样品中渐逝波仅在几百纳米玻璃/水界面内激发荧光团。

超分辨率显微镜

超分辨率显微镜允许在光学显微镜的衍射(分辨率)限制下成像。由于光的波动特性,一个无限小的光点在通过显微镜的光学系统时,在到达探测器前会模糊成200-300nm大小的光点。这意味着在衍射极限内的两个或多个物体将在最终的图像中呈现为一个物体。在过去的二十年里,许多技术已经发展,允许亚衍射极限成像。通常,这些技术可以使光学显微镜的分辨率提高2-10倍(见图1)。

显微镜技术表我应该使用什么显微镜技术进行实验?

当我考虑使用哪个显微镜用于新样本时,我总是首先询问两个问题:

1)样品动态或静态吗?

2)样品是否薄(<15μm)或厚?

这些问题将每个样本将每个样本分为四个类别中的一个,每个类别都适用于不同类型的现代荧光显微镜(见表1)。

薄的动态样本

例如:用荧光标记的直播细胞单层,运动结构

这些样品足够薄,可以静置在物镜的景深(焦点中会出现的轴向尺寸的距离)。这意味着图像会出现锐利而不会从模糊的焦点外部干扰干扰。在这些类型的样品中捕获最困难的特征是它们的快速运动。根据样本,可能需要对毫秒刻度的时间分辨率。最常见的是这些实验在荧光宽场显微镜上进行。这里,激发光从物镜突出,使得整个视野具有均匀的照明。然后收集来自样品中的所有染料分子的发射的荧光并突出回到快速,敏感的检测器,例如科学CMOS相机。

如果质膜动力学是实验的主要焦点,可以使用全内反射荧光(TIRF)显微镜。TIRF仅能激发几百纳米范围内的荧光团(4.)。基本上,实现了光学部分,其通过从样品中的荧光团中滤出从荧光团滤出发射光来提高对比度。在样品上也非常温和地对样品非常温和,因为大部分激光被反射远离样品,并且通过荧光团与渐逝能场的相互作用发生激发。

闪光片显微镜,其通过样品的多个焦平件的超薄激发光薄片也可用于提供快速成像以及光学切片(5.)。一个这样的例子是晶格光片,它向样品中投射许多薄的锥形光束。这些光束进行干涉,形成一个单一的激发光平面,这个平面比聚焦的样本部分更薄。该技术可用于提供高三维空间分辨率,同时避免高光照剂量对细胞的毒性影响。

薄静态样本

前:固定单层细胞或薄(<15μm)组织切片和3D培养物

这些样本不一定需要光学切片,而是将门打开到多种其他技术,该技术由于缺乏对高时成像速度的要求而提高了对比度和分辨率。标准荧光偏景显微镜可与去卷积相结合,一个数学软件后处理步骤,其将聚焦光重新分配到其各自的焦平面。在足够薄的样品中,通过更有效的摄像机检测器和缺少减小针孔,去卷积可能导致光学截面技术优于光学截面技术。通过收集更多光子,可以实现更高的信噪比(6)。

超分辨率技术,如结构照明(SIM),单分子定位(PALM/STORM),或可逆饱和光学线性荧光跃迁(RESOLFT/STED)也擅长于这些类型的样品。在超分辨率成像出现之前,光学显微镜在分辨近层结构方面的能力是有限的。这是因为通过光学显微镜光学的光发生了衍射。即使是一个无限小的光点——想象一个单一的GFP分子——在成像时也会以200-300纳米的模糊光点出现。超分辨率显微镜使用许多光学和化学“技巧”来打开和关闭荧光分子的子集。这可以提供2-10倍的分辨率,降低到10纳米。

厚的动态样品

前:3D细胞培养物,小型胚胎>15μm

Thsee是图像的一些最具挑战性的样本,因为它们需要光学切片,在大距离和高时的距离上成像。传统上,这种类型的样品与平行化的共焦技术成像,例如旋转盘共焦。然而,由于生物组织的散射性质,可能不可能成像超过80-100μm。因此,依赖于深度穿透的红外激发光的2-光子显微镜可以将成像深度靠近1mm的成像深度。传统上,2-Photon是一种非常慢的成像技术,但扫描仪技术和并行化的最新进步(7.)允许在大量3D体积上实时监测神经元活动。

除了2-光子显微镜外,由于其快速的时间分辨率和光毒性降低,灯椎间子显微镜显微镜显微镜显微镜显微镜显微镜迅速成为许多样品的优选技术。允许多视图成像的闪光片设计可以整体图像厚的散射样品,由于上述光穿透的限制,通过传统共聚焦不可能通过传统共聚焦来实现一些不可能的东西。

厚的静态样品

前:固定组织切片(>15μm),3D培养物和清除组织

这些样品总是需要某种形式的光学切片。点扫描共聚焦显微镜(见上文)通常为这种类型的样本提供最高质量的图像,因为它们在排除焦点灯之外最有效。然而,它们还通过激发光将样品从上底部延伸到底部,当在大轴向范围内获取多个图像时,可以导致光博。2-光子成像,限制激励和光漂移到焦平面,可用于克服这一点(8.)。

最近的组织清除技术的发展(9.)现在允许研究人员达到厘米的图像组织3.在尺寸方面。点扫描共聚焦和2-光子显微镜依靠像素构建整个图像像素不能提供该尺寸成像组织所需的帧速率。例如,通过适当的采样,将整个小鼠大脑图像近两个月才能使用20x / 1.0na目标。因此,需要通过灯表显微镜进行大型清除组织。虽然并非所有闪棋显微镜都可以覆盖这种尺寸的样本,但那些可以在几小时内完全图像的大组织的样品。

虽然光学显微镜技术的现代爆炸已经为生物学家提供了一系列工具,但在许多熟观中开放了门,这可能会压倒新手显微镜。希望这个简短的概要可以帮助您指向正确的方向。当您进入一组新的实验时,您当然不应该害怕在您的机构中寻求专业知识。


非常感谢我们的嘉宾博主,Doug Richardson!

Doug_Headshot.jpgDoug Richardson是哈佛大学分子和细胞生物学中的哈佛中心和讲师讲师。

在线其他资源

参考

1. Lichtman JW,Conchello Ja。荧光显微镜。自然方法2,910-919(2005)。PubMed.PMID:16299476.

2.Cochello Ja,Lichtman JW。光学切片显微镜。自然方法2,920-931(2005)。PubMed.PMID:16299477

3. Eggeling C,Willig Ki,Sahl SJ,地狱。基于镜头的荧光纳米镜。季度评论生物物理学48.,178-243(2015年)。PubMed.PMID:25998828

4. AXELROD D.细胞生物学中的全内反射荧光显微镜显微镜。方法酶酶361.,1-33(2003)。PubMed.PMID:12624904

5.用于多尺度成像的光片荧光显微镜指南。自然方法14.,360-373(2017)。PubMed.PMID:28362435

6. Pawley JB。生物共聚焦显微镜手册,第3 edn。Springer(2006)。

7。杨伟坚和拉斐尔·尤斯特。体内成像神经活动。自然方法14.4(2017):349-359。PubMed.PMID:28362436

8.深层组织双光子显微术。自然方法2,932-940(2005)。PubMed.PMID:16299478.

9. Richardson DS,Lichtman JW。澄清组织清除。细胞162,246-257(2015)。PubMed.PMID:26186186.

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