包装超过腺相关病毒大小限制的转基因的四种方法

由贝丝学会主席

Beth Kenkel.

腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)具有许多特性,是一种很好的病毒载体,但其包装容量仅为~4.7kb,约为其包装极限的一半慢病毒adenoviral向量。虽然许多转基因将符合这一限制,但有些人喜欢编辑的PE2酶没有。那么你如何将一个大基因融入一个小的载体AAV吗?通过把转基因分解成更小的片段。

片段基因组的重组是拟合大基因的关键

首先,一些历史。2008年,AuricChio实验室决定通过直接将〜9 KB的超大基因组包装出来解决“微小的载体,大转基因”问题。他们发现,在蔑视包装极限教条,这一AAV成功介导转基因全长基因的转导与表达体外在活的有机体内(Allocca等,2008)。不久之后,三个小组独立地尝试复制这些结果,并确定即使包装更大的载体基因组,基因组的物理大小仍然是~4.7kb。但尽管如此,转导后产生了更大的功能转基因产品。

这是怎么回事?其工作模式是将超大的AAV基因组打包后进行片段化或截断,然后在转导过程中,部分基因组相互补充以恢复全表达盒。AAV重组碎片基因组的天然能力是多种基因突变的基础分裂向量方法发展于2000年早期这使得研究人员能够运送超大的货物(Hirsch等人,2010)。

今天的博文将简要概述三种分裂载体策略和另一种分裂载体策略,用于增加crispr介导的同源定向修复(HDR)的AAV供体模板的大小。

拆分AAV矢量方法

分裂载体方法通过将基因分裂为A和b两部分来增加基因的大小。每个基因片段随后被独立包装成一个AAV。当细胞同时被a部分和B部分aav感染时,片段重新组装并产生全长基因。下面是四种分离AAV矢量方法的概述和缺点。

1.重叠

概述:重叠策略通常有一个同源区域~ 400 - 1400个基点在转基因的A和B部分之间重组全长转基因(ChamberLain等,2016)。通常接受通过该重叠区域发生某种形式的同源重组(HR),但是确切的机制尚不清楚。

两个分裂的转基因经历同源重组以创建完整的结构

缺点:

  • 通常,与使用单个过尺寸的向量相比,重叠分裂载体具有相等或更高的转基因表达,但不总是如此。
  • 血清型和组织/细胞型的结合可能对重叠AAV的转基因表达率有很大的影响,因为这两个变量都影响细胞是否被两个载体的多个拷贝共转导。

使用的例子:

  • Halbert等人,2002年使用重叠量为440或1000bp的重叠载体传递碱性磷酸酶小鼠气道上皮细胞的基因。该载体转导到约10%的细胞,与单一AAV转导率相似。
  • 奥多姆等人,2011采用重叠372 bp的重叠载体,将微型肌营养不良基因导入肌营养不良小鼠模型。在正常肌肉中,迷你型肌营养不良蛋白的表达量低于野生型肌营养不良蛋白的表达量,但经重叠分裂载体处理后,小鼠的肌肉生理性能有所改善。

2.跨剪接

概述:在转接过程中,使用剪接位点的供体和受体序列来重组转基因的两个片段。编码转基因A部分的AAV包含一个启动子和5’片段,然后是一个剪接位点供体。编码B部分的AAV基因在3’端之后包含一个剪接位点受体。当细胞被这两种病毒转导时,如果编码转基因a部分和B部分的AAV基因组形成异二聚体,则将转基因两部分的pre-mRNA剪接,重建全长转基因。

移植 - 分裂 -  aav

缺点:

使用的例子:

  • Lai等人,2005使用逆剪接载体向肌营养不良症的小鼠模型中递送6kb迷你染素基因。测试了三种不同的剪接部位供体和受体序列,并用最佳序列,该组达到〜80%的肌肉细胞表达迷你营养不良蛋白。

3.杂交

概述:混合方法结合了重叠和跨剪接方法。转基因的AAV编码部分A含有促进剂,转基因的5'一半,剪接供体序列和同源区域。转基因的AAV编码部分B包含同源性区域,接头受体序列,转基因的3'一半。通过重叠或跨剪接机制对全长基因重构。

剪接位点的供体和受体序列以及两个载体的同源区域可以来自于转基因的内源性内含子,也可以由非内源性序列组成,如a来自丝状噬菌体F1的77bp长的高重组同源序列(Trapani等,2014)。

Hybrid-split-AAV

缺点:

  • 的选择同源性序列可以影响转基因表达的水平,可能需要针对每个独特的应用程序进行优化(Trapani et al., 2015)。
  • 已经看到杂种方法的较小碎片的表达。虽然这些碎片可能是非功能性的,但它们可能是占主导地位和/或有毒的。潜在的解决方案是包括在5'剪接供体的上游和转基因的3'接头受体的下游的帧内劣质或劣化序列,以帮助防止这种截短的蛋白质的积累。

使用的例子:

  • Ghosh等人,2008年使用具有872bp长重组性同源序列的杂种分裂载体,将LacZ递送至小鼠的肌肉。通过β-半乳糖苷酶活性测量的来自杂化载体的表达为来自单个载体的81%,但显着大于来自重叠(34%)或反式剪接(62%)载体的表达。

4.顺序同源定向维修

概述:序列同源重组方法提供大的供体模板使用两个序列同源定向修复(HDR)与CRISPR/Cas9。供体A包含:与基因组整合靶点400bp同源臂,即转基因的“A部分”,介导供体模板整合,使整合后位点重构的gRNA靶位点;以及gRNA靶位点后的填充DNA序列。

Sequential-HDR

供体B包含:400bp同源臂给供体A和“转基因的”B部分“。

这两种AAVs在单个步骤中被共转导,并作为两个连续的crispr介导的HDR事件的供体,从而导致更大的供体模板的整合。

缺点:

  • 转基因表达随这种方法的不同而不同,在K562细胞系中〜10%在初级人T细胞和造血干细胞和祖细胞(HSPC)S中的〜40%表达(Bak等,2017)。
  • 由于这种方法依赖于双链DNA的断裂修复,如果非同源端连接在第一个HDR事件后扰乱GRNA目标站点,然后发生第二个HDR事件。
  • 最后,根据其设计,供体A可能能够表达截短的蛋白质。这可以通过在gRNA靶点下游的任何阅读框中排除供体a的终止密码子来避免不间断的衰变(Frischmeyer等人,2002年)。

如何选择分裂的AAV方法

由于转基因有两种重组方式,杂交双载体体系相对于重叠和反式剪接有微弱的优势,但目前还没有一种理想的分裂载体体系。总的来说,分裂载体的转基因表达效率一直不一致。对基础的更好理解AAV然而,生物学将有助于改善分裂载体策略并导致更大且更一致的转基因表达。

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引用:

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