使用CRISPR/Cas9生成小鼠模型

客人的博客

最后更新于2020年10月1日,阿莉娅·韦恩斯坦。

这篇文章是由客座博主秦文宁和王Haoyi。

CRISPR / Cas9正在革新老鼠基因靶向领域。长期以来,老鼠在实验室非常有用——它们相对较小,易于操作,使它们成为研究哺乳动物生物学的首选。与任何模型一样,小鼠也不是没有问题,但多年来人们利用它们积累了大量的基因和生理数据。事实上,老鼠研究的未来是光明的,因为现在使用CRISPR/Cas9比以往任何时候都更容易操纵老鼠基因组。

CRISPR小鼠模型

与人类的基因组相似,老鼠的基因组是由3 x 10组成的9核苷酸(nt)编码大约23000个基因。如果我们能直接进入并快速操纵单个老鼠的基因,研究它们在健康和疾病中的功能,那就太好了,但直到最近,这还不是那么容易。20世纪80年代,人们发明了基因靶向技术,将特定的变化引入小鼠基因组。利用这些早期技术,研究人员首先将突变引入小鼠胚胎干细胞(ESC)系,富集并选择成功结合了所需突变的细胞,然后从这些工程ESCs中培育出小鼠。为此,将工程ESCs注射到发育中的小鼠胚胎中,这些胚胎被允许发育成嵌合小鼠(与部分来自工程ESCs的成年小鼠的细胞),嵌合成年小鼠交配,产生完全转基因的后代。尽管这项技术功能强大,但使用起来很麻烦,效率不高,通常需要一年以上的时间来生成一个鼠标模型,而且它的成功并不总是有保证的。

要了解更多关于这个过程的信息,请查看我们的鼠标建模博客文章:第1部分:基因工程小鼠第2部分:繁殖和过杂鼠小鼠

我的第一个CRISPR老鼠实验

随着2013年CRISPR的出现,一切都改变了(, 2013) !郝毅第一次接触CRISPR是在他使用这项新技术设计小鼠模型时(, 2013,, 2013)。就像世界上的其他人一样,我(Wenning)被Crispr迷惑着着迷,并赶紧测试它。我仍然记得这一天,2014年3月16日,我掌握了我的第一次初步结果来自CrispRup Genome编辑实验。我在办公室里打开了一个序列文件。然后我看到了它,色谱图显示通过CRISPR引入的突变的触发迹象。序列开始干净,然后,大约100个bps进入运行,它得到了“脏”,具有多个序列迹线相互重叠!当计算完成时,该实验中的75%的小鼠显示出突变!我望着我的窗外,我看到了达尔山与阿卡迪亚国家公园的地平线的其他地平线。我很困惑。它应该很难。 I was mentally prepared to go through a learning curve that would result in success only after many attempts. Was I really successful in my first attempt at using CRISPR?

后来,我发现世界上很多人都在分享我的经历。是的,我们终于有了一项技术,CRISPR,它概念简单,使用简单,性能强劲。在自然环境中,CRISPR-Cas9是细菌和古细菌中的一种获得性免疫系统。如你所知,如果你一直在跟踪vwin.com mobile,它已被重新预先用于在真核生物中进行基因组编辑,具有最广泛使用的CRISPR基因组编辑系统来自酿脓链球菌。另一种Cas9,来自链球菌球菌,是在编辑小鼠胚胎方面和Cas9一样有效年代化脓性链球菌并且具有规模较小的优势(Zhang et al., 2016)。对于基因组编辑,CRISPR / Cas系统利用3组件,导游RNA (gRNA)约125元,指定目标,创建的Cas9酶DNA双链断裂(双边带)在目标网站,和捐赠的寡核苷酸或质粒作为修复材料如果需要(敲的模型)。

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CRISPR小鼠模型基础


用CRISPR/Cas9编辑小鼠基因组的过程

为了建立小鼠模型,将gRNA、Cas9和供体寡核苷酸或质粒成分放在一起,微注射到受精卵的原核或细胞质中。或者,避免接触胚胎体外,该技术被称为电穿孔进入怀孕雌性的输卵管通过输卵管核酸传递的基因组编辑,或性腺(Gurumurty等,2016)。AAV也可用作载体将CRISPR/Cas9注入孕妇的卵母细胞或输卵管(Yoon等人,2018,Mizuno等人,2018)。或者,可以将GRNA,CAS9和供体寡核苷酸电穿孔到小鼠Zygote中(, 2015)

在受精卵内部,gRNA会在3x10中寻找其靶点9小鼠基因组中的遗传含量和Cas9酶的NT将在靶位点切割。这是它令人兴奋的时候 - 细胞发出“SOS”信号和蜂窝修复机制急于修复损坏。如果他们所能做的一切都被缝合,两个断面结束了非同源终端连接(NHEJ),这将留下一个“伤疤”,核苷酸缺失或添加在断裂的末端,从而削弱基因。然而,如果提供了修复材料(以寡核苷酸或质粒的形式),就可以通过基因修饰对基因组进行精确的改变同源定向修复途径(HDR),无论是单核苷酸变化,插入一个报告基因,或替换鼠类序列与人类基因。

CRISPR用于小鼠基因组工程的优点

CRISPR小鼠模型生成与常规小鼠模型生成的比较从一开始,使用CRISPR产生鼠标模型比传统方法更容易。节省时间和金钱来自Carprpr Quale up,以至于您可以将试剂直接注射到受精的小鼠鸡蛋中,规避鼠标ESC提供的富集和选择的需求。例如,我们经常屏蔽15-25只小鼠,在产生Crasprprprp的淘汰赛模型时,发现许多情况下,如果不是全部,小鼠携带架构突变。对于用寡核苷酸敲入敲入寡核苷酸,我们的目的是产生50至100只小鼠,并且通常在衍生携带预期突变的小鼠方面是成功的。对于供体质粒,结果不太可预测。在我们最好的情况下,我们看到3只小鼠中的2只小鼠携带5 kB插入罗莎基因座,如南方印迹评估。

与更多常规方法相比,以上讨论的效率延长了Crispr鼠标编辑的4个主要优点。首先,与常规基因靶向相比,可以使用几乎任何小鼠的菌株,其限于少量菌株,包括129和C57BL / 6,我们具有各种菌株的ESC线。其次,这个过程更快。使用CRISPR产生创始小鼠需要3个月,而通过常规基因靶向的8至10个月相比。它还成本较低。随着CISPRP,产生创始小鼠的价格约为5,000美元,而在常规基因瞄准的同时,成本可能为50,000美元。最后,与传统的基因组工程方法相比,CRISPR在产生想要的突变后代方面效率更高,使用ESC时的成功率为85%,而使用ESC时的成功率为50% (Cohen, 2016)。

请参阅我们最近的文章,了解小鼠CRISPR基因编辑技巧

使用CRISPR生成小鼠模型的缺点

尽管CRISPR非常有用的生成通过与HDR NHEJ和生成小突变,突变时大规模基因组编辑,如更换一只老鼠基因与人类直接同源(大于5 kb),还有待观察是否CRISPR传统基因打靶一样健壮。CRISPR工具最近被用于将一个25kb的人类基因导入小鼠基因组。然而,只有3.4%的创业者建立了该基因的种系传递,该技术仍有待改进。此外,在与CRISPR合作时,必须注意不是所有的grna都是平等的。有些工作比其他的好。网上有很多资源可以指导你设计gRNA。我们一直在使用卧改,但还有许多其他的可用GRNA设计工具你还可以从约翰·多奇那里得到一些额外的建议gRNA设计博客。最后,永远记住你是在与rna一起工作,它们容易被无处不在的RNase降解。您可能想声明您的工作台“RNase免费”,并避免与朋友和同事交谈,而工作与这些试剂。除此之外,对你的微注射员好点,他的任务很重要,就是运送有效载荷!

最后但并非最不重要的是,在使用CRISPR时,记得欣赏它在一个模糊的细菌中首次发现它的事实,我们仍然有很多东西在所有形式中学习生物学!


非常感谢我们的客座博主秦文宁和Haoyi王!

温家宝秦Wenning Qin是一种具有生物原性的分子生物学家,特别感兴趣地对鼠标基因组编辑应用Crispr。

Haoyi王郝省王是中国科学院动物学研究所教授,他有兴趣利用CRISPR开发更好人体健康的治疗应用。

参考文献

Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F(2013)基于CRISPR/Cas系统的多基因组工程。科学339:819 - 823。https://doi.org/10.1126/science.1231143

Doench JG, Hartenian E, Graham DB, Tothova Z, Hegde M, Smith I, Sullender M, Ebert BL, Xavier RJ, Root DE(2014)合理设计高效sgrna用于crispr - cas9介导的基因失活。Nat生物技术32:1262-1267。https://doi.org/10.1038/nbt.3026

Gurumurthy CB,Takahashi G,Wada K,Miura H,Sato M,Ohtsuka M(2016)Gonad:一种新型CRISPR / CAS9基因组编辑方法,不需要胚胎的emVivo处理。人类遗传学中的当前方案88:。https://doi.org/10.1002/0471142905.HG1508S88

Leidy-Davis T, Cheng K, Goodwin LO, Morgan JL, Juan WC, Roca X, Ong ST, Bergstrom DE(2018)使用胚胎干细胞/囊胚和CRISPR/受精卵注射方法创建了具有广泛基因人化(25 kbp)的活鼠。科学代表8:。https://doi.org/10.1038/s41598-018-33408-9

Mizuno N, Mizutani E, Sato H, Kasai M, Ogawa A, Suchy F, Yamaguchi T, Nakauchi H(2018)利用腺相关病毒载体进行CRISPR/ cas9介导的基因组编辑,实现胚胎内基因盒式敲入。iScience 9:286 - 297。https://doi.org/10.1016/j.isci.2018.10.030

Qin W, Kutny PM, Maser RS, Dion SL, Lamont JD, Zhang Y, Perry GA, Wang H(2016)利用CRISPR‐Cas9‐介导的基因组编辑技术构建小鼠模型。当前小鼠生物学协议6:39-66。https://doi.org/10.1002/9780470942390.mo150178

Qin W, Dion SL, Kutny PM, Zhang Y, Cheng AW, Jillette NL, Malhotra A, Geurts AM, Chen Y- g, Wang H(2015)基于合子电穿孔的CRISPR/ cas9介导的小鼠基因组编辑。遗传学200:423 - 430。https://doi.org/10.1534/Genetics.115.176594

杨H,王H,Shivalila CS,Cheng AW,Shi L,Jaenisch R(2013)CRISPR / CAS介导的基因组工程携带报告和有条件等位基因的一步生成。电池154:1370-1379。https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.08.022

Yoon Y, Wang D, Tai PWL, Riley J, Gao G, Rivera-Pérez JA(2018)基于重组腺相关病毒的小鼠胚胎体外和体内基因组编辑。Nat commen 9:。https://doi.org/10.1038/s41467-017-02706-7

Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R(2013)利用CRISPR/ cas介导的基因组工程一步生成多基因突变小鼠。细胞153:910 - 918。https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.04.025

张霞,梁鹏,丁超,张智,周杰,谢旭,黄锐,孙勇,孙浩,张杰,徐勇,松阳珍,黄杰(2016)金黄色葡萄球菌Cas9高效生产转基因小鼠。科学代表6:。https://doi.org/10.1038/srep32565

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