基因编码稀疏细胞标记-创新的SPARCgydF4y2Ba

通过读经文温斯坦gydF4y2Ba

直到最近,还没有完全遗传的工具可以让研究人员对单个遗传定义的细胞子集的一小部分进行标记。通过标记群体中更少的细胞,更容易看到个体/不重叠的细胞。而gydF4y2Ba转基因动物gydF4y2Ba通常是用来专门操纵一种细胞类型的兴趣在一个生物体,所有的细胞类型的影响。gydF4y2Ba以前的工具克服了这一限制gydF4y2Ba包括一个gydF4y2Ba基于aav的稀疏标记系统gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba少量的AAV被注射进大脑gydF4y2Ba(Lin et al., 2018)。然而,该系统需要对AAV进行精确的滴定。到目前为止,克服这一挑战的工具gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba需要gydF4y2Ba热冲击系统或使用化学诱导剂gydF4y2Ba(del Valle Rodríguez et al., 2011)。gydF4y2Ba

遗传学的SPARCgydF4y2Ba

SPARC和SPARC2结构示意图gydF4y2Ba

图1:SPARC和SPARC2使用GAL4-UAS系统和精确截断的attP位点来控制基因构建的重组。一定数量的细胞将表达效应器或保留重组后的停止盒。从图片gydF4y2BaIsaacman-Beck等人,2019gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

通过重组酶竞争稀疏预测活性gydF4y2Ba(SPARC)gydF4y2BaggydF4y2Ba允许标签的遗传工具gydF4y2BaggydF4y2Ba细胞的一个子集gydF4y2BaggydF4y2Ba遗传组成,克服了所有这些劳动密集型和侵入性技术,可靠地标记任何后有丝分裂细胞gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba。SPARC是由gydF4y2Ba托马斯Clandinin的实验室gydF4y2Ba,并合并了几个公共gydF4y2BaggydF4y2Baenetic工具gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba(FigydF4y2BaggydF4y2Ba。1)gydF4y2Ba:gydF4y2Ba

  • GAL4-UASgydF4y2Ba,是转录因子结合位点。在果蝇中表达的GAL4与UAS结合基序结合,驱动下游基因的表达。gydF4y2Ba
  • attP和attBgydF4y2Ba,重组网站。这些位点是PhiC31的目标序列。在SPARC系统中,attP位点位于一个停止盒的两侧,一个效应基因的上游。在细胞中,停止盒在重组步骤中被移除,效应器被表达。在停止盒存在的细胞中,效应蛋白不表达,细胞也不被标记。gydF4y2Ba
  • PhiC31gydF4y2Ba重组酶。它专门将一个attP站点集成到一个attB站点中。在SPARC系统中,PhiC31不可逆地重组两个相互竞争的attP位点中的一个,以驱动停止盒式或效应基因的表达。gydF4y2Ba
  • HDVRgydF4y2Ba(2X丁型肝炎病毒核酶),一种自裂核酶。在第二代SPARC2系统中,HDVR被放置在第二个attP位点的上游,用于切割和灭活效应基因的任何读透转录本。gydF4y2Ba
  • 效应的基因gydF4y2Ba,任何你想用SPARC系统来控制表达的基因。效应器位于SPARC其他成分的下游,表达受上游重组结果控制。gydF4y2Ba

在Addgene找到SPARC质粒gydF4y2Ba

为了更精确地控制标注量,您可以更改attP站点。截断终止盒上游的attP位点会降低重组效率,并优先导致重组后终止盒仍然存在的基因构建。这种策略导致对表达SPARC的细胞群体进行稀疏标记,在给定的群体中被标记的细胞的比例与被截断的attP位点的长度直接相关。根据attP位点的长度,这三种SPARC变体允许密集(D)、中间(I)或稀疏(S)标记细胞群。gydF4y2Ba

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图2:钙指示剂GCaMP6f在果蝇视叶中的密集(c)、中间(d)、稀疏(e)标记。从图片gydF4y2BaIsaacman-Beck等人,2019gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

SPARC申请gydF4y2Ba

SPARC技术具有广泛性,可以通过替代转录因子结合位点和效应位点,应用于不同细胞类型和生物体。在gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba, SPARC系统既可用于可视化,也可用于gydF4y2Ba光遗传学gydF4y2Ba。SPARC Clandinin实验室用于图像钙响应的T5神经元的树突将钙指标GCaMP6f效应的位置,以及使用CsChrimson optogenetically R2神经元的去极化控制::tdTomato, optogenetic工具(CsChrimson)连接到一个荧光指示剂(tdTomato),效应。他们还扩展了SPARC系统,使用其他实验性转录激活系统,如gydF4y2BaLexA / p65gydF4y2Ba或gydF4y2BamCD8 / GFPgydF4y2Ba,允许在各种类型的苍蝇细胞中进行稀疏标记。因为PhiC31重组酶可以在包括老鼠和鱼在内的其他模式生物中工作,SPARC很可能也适用于其他系统。gydF4y2Ba

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